自身免疫性肝炎的发病率呈上升趋势,已经严重威胁到人类的健康。因此,对其发病机制和防病策略的研究越来越受到重视。近年来发现,免疫调节机制在自身免疫性肝炎中起着重要的作用,免疫相关分子和细胞与疾病的发生发展密切相关。虽然已有一些与免疫相关的病因解释,但是目前对于其发病的真正的免疫学机制尚未深入了解。因此,寻找到与其相关的免疫学发病原因对于自身免疫性疾病的治疗有着重要的指导作用。Con A诱导的肝炎是急性肝炎的一个很好的动物模型。它模拟了人类自身免疫性肝炎的病理过程。在Con A诱导的自身免疫性肝炎小鼠体内,许多细胞因子升高,包括了(?)TNF-α, IL-6, IFN-γ, and IL-1。其中TNF-α在急性肝脏炎症的组织损伤中起着重要的作用。在炎症的早期阶段,TNF-α直接导致了肝细胞损伤。实验证明,在本模型中,阻断TNF-α可以有效的保护小鼠,防止肝损伤的发生。由单核巨噬细胞,T细胞和B细胞分泌的IL-6具有广泛的生物学活性,其在本模型的急性期阶段也起着重要的作用。新近研究发现：IL-17在自身免疫性肝炎患者的血清中上调表达,但是IL-17在该病中的作用机制不清楚。因此,我们的实验以Con A诱导的自身免疫性肝炎为模型,分析IL-17在Con A诱导的自身免疫性肝炎中的表达,以及IL-17的表达在Con A诱导的自身免疫性肝炎中的作用,进一步分析产生IL-17的细胞亚群,初步探讨IL-17在Con A诱导的自身免疫性肝炎中的作用机制,以期为自身免疫性肝炎防治提供新的理论基础和实验依据。第一部分IL-17在Con A诱导的自身免疫性肝损伤中的表达我们以高剂量Con A处理小鼠建立自身免疫性肝损伤模型。尾静脉给予小鼠高剂量的Con A, PBS处理组作为对照,12小时后检测血清转氨酶(ALT)和肝病理损伤的变化。从血清学指标来看,Con A处理组小鼠血清转氨酶(ALT)水平较PBS处理组小鼠显著升高；小鼠肝组织病理检查结果显示,Con A处理组显示大量浸润的炎性细胞在肝组织扩散并导致局部肝细胞坏死；PBS处理组没有出现炎性细胞浸润。另外,我们检测了模型小鼠血清中TNF-α和IL-6的水平,作为导致组织损伤最重要的细胞因子TNF-α和IL-6在Con A处理组显著升高。因此通过以上结果证明我们成功诱导了肝损伤,建立了Con A诱导的自身免疫性肝损伤模型。为了了解IL-17在本模型中是否起作用,我们利用TaqMan探针的实时荧光定量PCR和ELISA技术检测了IL-17在模型小鼠肝组织中的表达变化情况,同时比较了IL-17的表达水平与肝脏损伤程度的相关性。实验结果表明,IL-17在Con A诱导的免疫性肝损伤组织中显著上调表达,IL-17表达水平与肝脏损伤程度正相关,提示IL-17表达与免疫性肝损伤具有一定的相关性,IL-17的上调表达可能参与了免疫性肝损伤的病理发生。第二部分IL-17在Con A诱导的自身免疫性肝损伤中的作用通过第一部分的实验证明在Con A诱导的自身免疫性肝损伤小鼠肝脏局部,IL-17增多。在本部分中,我们着重研究IL-17在本模型中所起的作用。首先,我们进行了特异性IL-17单克隆抗体的体内阻断实验,观察肝脏病理变化,检测ALT水平、TNF-α和IL-6表达变化,评估抗IL-17单克隆抗体对Con A诱导的自身免疫性肝损伤的影响,初步探讨它的可能机理。实验结果表明,特异性IL-17单克隆抗体干预明显降低了血清ALT水平(p<0.05)、改善了肝脏病理损伤、降低了肝脏组织中促炎症物质如TNF-α和IL-6的表达水平。这些实验资料说明,抗IL-17单克隆抗体对Con A诱导的自身免疫性肝损伤具有明显的保护作用,IL-17促进相关的炎症细胞因子TNF-α和IL-6的释放可能是导致肝脏损伤的重要机制之一。其次,为了进一步了解内源性IL-17在Con A诱导的急性肝损伤中的作用,我们用表达可溶性的IL-17R:Fc融合蛋白重组腺病毒载体(AdIL-17R:Fc)处理小鼠。这种融合蛋白可以与IL-17R结合,从而阻断IL-17的传导通路。结果显示,经可溶性的IL-17R：Fc融合蛋白重组腺病毒载体处理后,血清中转氨酶水平明显降低同时肝细胞坏死减轻。同时,与肝损伤水平相平行,可溶性的IL-17R：Fc融合蛋白重组腺病毒载体阻断IL-17与其受体结合后,TNF-α和IL-6明显下降。以上结果提示,阻断IL-17信号通路可以明显地减轻Con A诱导的急性肝损伤,并且此过程与阻断了在本模型中重要的细胞因子TNF-α和IL-6相关。最后,我们构建了含有细胞因子IL-17的真核表达质粒。我们以钙转法将质粒导入Huh7细胞,获得含IL-17转染细胞。将以上转染细胞的表达上清浓缩后进行ELISA分析可见明显IL-17表达,证实以上所构建的重组质粒能够在体外进行有效表达。体内实验显示：该质粒注射小鼠后,小鼠体内的IL-17明显升高。以上结果提示：所有构建的重组质粒可在体内外得到有效表达。尾静脉高压注射质粒pcDNA3.1-IL-17上调小鼠体内的IL-17,明显的加重了模型小鼠的肝损伤程度。实验结果证明,血清ALT较对照组明显增高,并且伴有肝脏细胞坏死面积扩大。更重要的是,相关炎症细胞因子TNF-α和IL-6也较对照组明显升高。这些数据提示,IL-17与Con A诱导的自身免疫性肝炎有着密切的关系。第三部分Con A诱导的自身免疫性肝损伤中IL-17的来源我们已经证明IL-17在Con A诱导的自身免疫性肝炎中起着重要的作用。鉴于以上原因,研究本模型中IL-17的细胞来源对于自身免疫性肝炎的发病机制的研究具有重要的意义。我们检测了Con A诱导的自身免疫性肝炎模型中肝脏局部的单个核细胞分泌IL-17的情况,实验结果显示,肝脏局部分泌IL-17的细胞比例较对照组明显升高,所以我们认为在肝脏损伤中起着作用的IL-17是肝脏局部细胞分泌的。鉴于此,我们首先检测了Con A诱导的自身免疫性肝损伤中分泌IL-17的T细胞,我们发现在模型小鼠的肝脏中分泌的IL-17的T细胞比例,与前述测得的其在总细胞中的比例一致,这提示,肝脏局部分泌IL-17的细胞主要是T细胞。因此,我们在T细胞的基础上,由荧光标记的抗CD4与抗CD8抗体染色检测了不同的T细胞亚群分泌IL-17的情况。实验结果提示,IL-17主要是由CD4+CD8-和CD4-CD8-这两群T细胞分泌的,表示这肝脏局部产生IL-17的细胞来源存在着通常意义上的Th17细胞,即分泌IL-17的CD4+T细胞。但是,这里还存在着一群异于常规的分泌IL-17的细胞群,既CD4-CD8-T细胞亚群。同时我们发现,NKT细胞的数量和比例在肝脏中Con A处理组较对照组明显升高。进一步我们检测了这些细胞中IL-17的表达情况,细胞内染色表明,表达IL-17的NKT细胞在Con A处理组较PBS对照组也明显升高。这些结果提示,CD4+T和NKT细胞是Con A诱导的自身免疫性肝炎中IL-17的主要来源。第四部分IL-17在Con A诱导的自身免疫性肝损伤中的作用机制上述实验结果证实,IL-17在Con A诱导的自身免疫性肝损伤模型中起着重要的作用,在这部分中,我们通过检测IL-17对于Kupffer细胞的作用,对IL-17在Con A诱导的肝损伤模型中的作用机制进行了初步的探讨。首先,我们检测了模型小鼠肝脏局部的Kupffer细胞的IL-17R的表达情况。结果显示,在Con A处理后12小时,Kupffer细胞表达IL-17R较对照组增加。然后,我们分离了模型小鼠肝脏中Kupffer细胞,发现在体外用IL-17刺激可以明显增加这些细胞TNF-α和IL-6的释放。这些结果提示,IL-17及其受体结合可以直接促进Kupffer细胞的活化。此外,我们用GdCl3抑制了Kupffer细胞的功能后发现,Con A处理后,小鼠的ALT水平没有升高,并且相关细胞因子TNF-α和IL-6也没有升高。这些结果提示IL-17及其受体结合后可以促进Kupffer细胞分泌TNF-α和IL-6,而它们则直接导致了肝脏损伤。综上所诉,本研究阐明了CD4+T和NKT细胞分泌的IL-17在Con A诱导的自身免疫性肝损伤中起着重要的作用。同时,我们还证明了这些T细胞来源的IL-17的病理学作用主要是通过诱导肝脏局部Kupffer细胞释放TNF-α和IL-6发挥作用。因此,我们认为T细胞-IL-17-Kupffer细胞通路是自身免疫性肝炎的新的治疗靶点。