第一部分LncRNA TUG1/miR-145-5p在慢性阻塞性肺疾病急性加重中的临床研究引言慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是一种常见的由有毒颗粒或气体导致的气道和（或）肺泡异常引起的以持续呼吸道症状和气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病。COPD急性加重（acute exacerbation of COPD,AECOPD）主要表现为患者呼吸系统症状急性恶化,超出日常变异,需要改变药物治疗。AECOPD是影响患者疾病整体严重程度的重要因素。COPD患者每年约发生0.5-3.5次急性加重,每人每次平均住院费用高达1.2万元,严重增加了患者及社会的经济负担。同时,AECOPD患者肺功能显著下降,严重影响患者运动能力及生活质量,加重死亡风险。呼吸系统感染是AECOPD发生的最常见诱因,80%的AECOPD是由感染所致,其中细菌感染占40-60%,病毒感染占30-50%。AECOPD病毒感染谱具有一定的地域和种族差异,鼻病毒是欧美国家AECOPD最常见病原体,流感病毒是亚洲国家AECOPD最常见病原体。本课题组前期临床研究表明流感病毒是我国AECOPD早期发生的最常见触发因子。AECOPD病情严重程度的评估主要依据患者呼吸系统症状、体征以及是否合并呼吸衰竭等并发症。实验室检查如血常规、C反应蛋白、降钙素原等在制定AECOPD治疗方案中具有一定的参考作用,值得注意的是,目前尚无特异性生物标志物可以预测AECOPD。人类基因组学研究发现,基因库中除编码蛋白的基因外,还存在大量的非编码RNA（non-coding RNAs,ncRNAs）,长链ncRNAs（long non-coding RNAs,lncRNAs）是一类长度>200nt的一类RNA,此类RNA缺少或无开放阅读框,因此不参与多肽的产生,仅在转录及转录后水平调控蛋白质的编码。LncRNAs的异常表达可能参与多种疾病的发生发展。LncRNAs由于其特殊的生物学特征,并不直接在生命体活动中发挥作用,现有研究表明:大部分LncRNAs主要是通过抑制微小RNA（micro RNA,miRNA）的表达发挥作用。miRNAs是一类长度在几个到二十几个核苷酸短链非编码RNA,广泛存在于各种生物体中,其作用机制主要是与靶蛋白编码基因的mRNA互补结合,继而调控目标蛋白的表达及功能。COPD患者体内存在多种异常表达的miRNA,这些异常表达的miRNAs可特异性作用于相应的目标蛋白,参与COPD粘液高分泌、肺泡壁的破坏、肺组织纤维化和小气道重塑等病理过程。长链非编码RNA牛磺酸上调基因1（taurine upregulated gene 1,TUG1）最早发现于鼠科动物的视神经纤维细胞中,全长7.1kb,是一种与染色质修饰复合物相关的lnc RNA。lncRNA TUG1不仅参与胃肠道及生殖系统肿瘤的增殖,还与炎症性肠病、系统性红斑狼疮的发生密切相关。通过检测COPD和正常人肺组织中lncRNAs/miRNAs的表达,发现COPD患者肺组织中lncRNA TUG1显著增高,同时伴miR-145-5p明显下降。然而有关lncRNA TUG1、miR-145-5p在COPD急性加重期患者体内的表达情况及二者与AECOPD患者肺功能参数、细胞炎症因子间的相关性鲜有报道。本研究中,拟通过收集COPD急性加重期患者、稳定期COPD患者及正常对照组人群的外周静脉血、肺功能参数等临床资料,分离提取人外周静脉血单核淋巴细胞,以β-actin为内参,检测外周血单核细胞中lncRNA TUG1、miR-145-5p的相对表达量,分析二者与AECOPD患者肺功能参数、血清细胞炎症因子指标间的相关性。旨在为临床上预测和评估COPD急性加重病情严重程度提供新的实验室生物标志物。目的在临床水平观察lncRNA TUG1、miR-145-5p在COPD急性加重期患者外周血单核细胞中的表达,以及lncRNA TUG1、miR-145-5p与COPD急性加重期患者肺功能参数及相关血清细胞炎症因子之间的关系,探索lncRNA TUG1、miR-145-5p在COPD急性加重患者中病情评估中的作用。方法收集2018年1月-2019年12月180例受试者（包括正常对照组50例、COPD稳定期患者50例、COPD急性加重期患者80例）。采集受试者一般资料、肺功能、外周血血清等资料,提取外周血单核细胞,检测患者外周血单核细胞RNA中lncRNA TUG1、miR-145-5p。比较COPD稳定期、急性加重期及正常对照组外周血单核细胞中lncRNA TUG1、miR-145-5p表达差异,以及与COPD急性加重期患者肺功能参数及血清细胞炎症因子之间的关系。结果1、COPD急性加重期患者外周血单核细胞中lncRNA TUG1的相对表达量显著高于COPD稳定期及正常对照组,COPD稳定期患者外周血单核细胞中lncRNA TUG1的相对表达量显著高于正常对照组。2、COPD急性加重期患者外周血单核细胞中miR-145-5p的相对表达量显著低于COPD稳定期及正常对照组,COPD稳定期患者外周血单核细胞中miR-145-5p的相对表达量显著低于正常对照组。AECOPD患者外周血单核细胞中lncRNA TUG1与miR-145-5p的表达呈显著负相关。3、COPD急性加重期患者外周血单核细胞中lncRNA TUG1的相对表达量与肺功能参数FEV1%、FVC显著负相关,而miR-145-5p与肺功能参数FEV1%、FVC显著正相关。4、COPD急性加重期患者外周血单核细胞中lncRNA TUG1的相对表达量与外周血中IL-1β及TNF-α显著正相关,而miR-145-5p与外周血中IL-1β及TNF-α显著负相关。结论COPD急性加重期患者体内LncRNATUG1的表达量显著高于稳定期和正常人,伴miR-145-5p显著降低。AECOPD患者体内LncRNATUG1与miR-145-5p的表达显著负相关。AECOPD患者外周血单核细胞中lncRNA TUG1、miR-145-5p的相对表达量与肺功能参数FEV1%及FVC、外周血细胞炎症因子IL-1β及TNF-α均明显相关。lncRNA TUG1、miR-145-5p可能成为预测和评估AECOPD患者病情严重程度的新型实验室生物标志物。第二部分流感病毒H3N2激活lncRNA TUG1/miR-145-5p/NF-κB信号通路调控慢性阻塞性肺疾病急性加重气道炎症反应的分子机制研究引言流感病毒是上呼吸道感染的常见病原体之一,也是引起慢性阻塞性肺疾病急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD）的常见诱因,临床研究表明流感病毒可早期触发COPD患者气道炎症反应、继而导致呼吸系统症状急剧恶化。慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）患者较正常人更易出现流感病毒感染,且感染后炎症反应显著高于正常人,然而有关COPD患者对流感病毒的高易感性以及感染后的气道炎症反应发生的具体机制尚不明确。了解和掌握AECOPD患者气道炎症反应发生的分子机制对于临床防治AECOPD具有重要意义。长链非编码RNA牛磺酸上调基因1（taurine upregulated gene 1,TUG1）最早发现于鼠科动物的视神经纤维细胞中,全长7.1Kb,是一种与染色质修饰复合物相关的lnc RNA,在基因调控中发挥重要作用。相关研究表明lncRNA TUG1在多种疾病的发生发展中可能扮演重要作用,通过比较COPD患者和正常人肺组织中lnc RNAs的表达,发现lncRNA TUG1在慢阻肺患者肺组织中显著增高,抑制lncRNA TUG1的表达可显著降低基质金属蛋白酶MMP-9的表达,继而改善慢阻肺患者气道重塑。Lnc RNA可通过多种机制调控蛋白的表达。通过生物信息学方法发现lncRNA TUG1可靶向结合miR-145-5p,而miR-145-5p可靶向结合NF-κBp65 3’UTR,NF-κB是调节炎症反应的经典信号转录因子,既往研究已证实其在COPD炎症反应的中作用。结合miR-145-5p在COPD患者中的表达及相关研究报道,我们提出假设lncRNA TUG1可能通过靶向结合miR-145-5p调控NF-κB信号通路,从而调控流感病毒感染后慢阻肺急性加重的气道炎症反应。目的从细胞水平探索lncRNA TUG1/miR-145-5p/NF-κB信号通路调控流感病毒感染后诱发COPD急性加重气道炎症反应的分子机制。材料和方法采用酶消化法分离正常和COPD原代气道上皮细胞,观察流感病毒H3N2感染正常和COPD原代气道上皮细胞24小时后NF-κB信号通路激活情况,以及流感病毒H3N2感染前后lncRNA TUG1、miR-145-5p表达情况。采用sh RNA法抑制COPD原代气道上皮细胞中lncRNA TUG1,并观察抑制lncRNA TUG1后对H3N2感染COPD原代气道上皮细胞炎症反应的影响。采用miR-145-5p mimic/inhibitor以及NF-κBp65过表达质粒分别转染COPD原代气道上皮细胞,观察COPD原代气道上皮细胞中miR-145-5p及NF-κBp65表达的改变对流感病毒H3N2感染后气道炎症的影响。荧光素酶报告基因检测进一步探讨lncRNA TUG1/miR-145-5p/NF-κB信号通路调控流感病毒感染后诱发COPD急性加重气道炎症反应的分子机制。结果Lnc RNA TUG1在COPD原代气道上皮细胞中的表达显著高于正常者,而miR-145-5p在COPD原代气道上皮细胞中的表达显著低于正常者。流感病毒H3N2感染原代气道上皮细胞24小时后,lncRNA TUG1表达显著增高,伴活化的NF-κB信号通路及降低的miR-145-5p。COPD原代气道上皮细胞感染H3N2后NF-κB信号通路激活时间显著早于正常原代气道上皮细胞,且细胞因子TNF-α、IL-1β的表达量亦明显高于正常原代气道上皮细胞。采用sh RNA抑制lncRNA TUG1后可显著降低H3N2感染后NF-κB信号通路激活。采用miR-145-5p mimic转染COPD原代气道上皮细胞亦明显抑制H3N2感染后NF-κB信号通路激活。而采用miR-145-5p inhibitor或过表达NF-κBp65后可有效逆转sh RNA抑制的COPD气道炎症反应。结论1、流感病毒H3N2感染后COPD原代气道上皮细胞后激活NF-κB信号通路显著早于正常原代气道上皮细胞;2、流感病毒H3N2感染可显著提高原代气道上皮细胞lncRNA TUG1的表达,并降低miR-145-5p的表达,且抑制lncRNA TUG1可有效减轻H3N2感染原代气道上皮细胞后炎症反应;3、lncRNA TUG1可能通过抑制miR-145-5p调控NF-κB信号通路,从而参与流感病毒诱发COPD急性加重的早期气道炎症反应。