一、研究背景心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,IR）使心肌细胞凋亡增加,导致再灌注后心功能不全,是制约心血管手术临床疗效的重要因素。如何有效地降低IR后心肌细胞凋亡,减少心肌损伤,保护心功能,一直都是心血管领域基础和临床研究的热点。近来研究发现,心肌IR时会引起严重的氧化应激,产生大量活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）,触发内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）,诱发氧化型钙/钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(ox-Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,ox-CaMKⅡ)激活,导致心肌细胞凋亡。心肌IR发生时,CaMKⅡ能够介导细胞内Ca²⁺超载而加重心肌IR损伤。晚近有学者发现新型气体分子氢（Hydrogen,H₂）可以在IR中选择性抗氧化而发挥保护作用。我们推测,H₂可能通过减少心肌IR后ROS的产生,调节ERS,降低CaMKⅡ的活化,减少细胞Ca²⁺([Ca²⁺]i),维持细胞内钙稳态,从而抑制心肌细胞凋亡,发挥保护心功能的作用。二、研究目的1、明确分子氢在心肌IR损伤中的心肌保护作用;2、阐明分子氢在心肌IR中保护心肌的分子机制。三、研究方法（一）H₂调节ERS影响细胞凋亡的实验研究乳鼠心肌细胞先经低氧（1%氧气+5%二氧化碳+94%氮气）培养30min,然后正常（5%二氧化碳+95%空气）培养120min,以建立细胞缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation,HR）模型。实验用细胞随机分为3组:Con组、HR组和H₂组（先使用0.6m M富氢DMEM培养基培养30min,再进行HR）。采用CCK-8测定心肌细胞活力,二硝基苯肼比色法测定培养液上清中LDH含量,ELISA法测定培养液上清中cTnI含量,流式细胞仪测定细胞凋亡率,以及Western blot检测CHOP、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。（二）H₂调节ERS-CaMKⅡ-Ca²⁺超载影响细胞凋亡机制研究1、CHOP介导H₂影响CaMKⅡ氧化激活的研究构建大鼠CHOP基因过表达慢病毒载体（Lv-CHOP）和CHOP基因短发卡RNA（sh RNA）慢病毒载体（Lv-sh RNA）,分别转染乳鼠离体心肌细胞以上调或下调CHOP的表达水平。采用与第1部分相同方法构建离体细胞HR模型。实验用细胞随机分为7组:Con组、HR组、H₂组、HR+Lv-CHOP组（采用Lv-CHOP转染的细胞,处理同HR组）、HR+Lv-CHOP+H₂组（采用Lv-CHOP转染的细胞,处理同H₂组）、HR+Lv-sh RNA组（采用Lv-sh RNA转染的细胞,处理同HR组）和HR+Lv-sh RNA+H₂组（采用Lv-sh RNA转染的细胞,处理同H₂组）。采用Western blot检测ox-CaMKⅡ和CaMKⅡ蛋白的表达水平。2、CaMKⅡ介导H₂影响细胞内Ca²⁺超载的研究同第1部分方法建立离体心肌细胞HR模型,使用KN-93特异性阻滞CaMKⅡ激活。实验用细胞随机分成5组:Con组、HR组、H₂组、HR+KN-93组（细胞先在含2μM KN-93的DMEM培养基中培养30min,后处理同HR组）和HR+H₂+KN-93组（细胞先在含2μM KN-93的富氢DMEM培养基中培养30min,后处理同HR组）。采用流式细胞仪检测细胞内Ca²⁺([Ca²⁺]i)和细胞凋亡率,以及Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。（三）H₂调节ERS影响细胞凋亡的在体验证研究通过结扎冠状动脉左前降支缺血30min,随后再通恢复灌注120min建立大鼠心肌IR模型。30只SD大鼠随机分为3组:Sham组（只进行开胸手术）、IR组和H₂组（再灌注前5min给予腹腔注射10m L/kg富氢生理盐水）。再灌注后120min测定大鼠的左心室收缩压（LVSP）和左心室等容收缩期压力最大变化速率（+dp/dtmax）,Evans-Blue/TCC双染色测定心肌梗死面积。采用免疫组织化学法测定心肌中8-OHd G和3-NT的阳性表达指数,二硝基苯肼比色法测定血清中LDH含量,ELISA测定血清中c Tn I含量,TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数,以及Western blot检测CHOP、ox-CaMKⅡ、CaMKⅡ、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。四、研究结果（一）H₂调节ERS影响细胞凋亡的实验研究1、H₂改善心肌细胞HR后细胞活力各组心肌细胞的细胞活力分别为:Con 98.8±1.0%,HR 32.6±5.2%,H₂ 59.3±3.9%,其中H₂组显著高于HR组（P<0.001）,提示H₂可改善心肌细胞HR后细胞活力。2、H₂减少心肌细胞HR后损伤各组心肌细胞培养液上清中LDH含量分别为:Con 12.2±1.7 U/L,HR 24.7±3.1U/L,H₂ 19.3±2.9 U/L,其中H₂组显著低于HR组（P=0.047）;各组培养液上清中c Tn I含量分别为:Con 68.2±8.8 ng/L,HR 127.8±16.6 ng/L,H₂ 95.7±7.6 ng/L,其中H₂组显著低于HR组（P=0.015）,提示H₂可减少心肌细胞HR后损伤。3、H₂减少心肌细胞HR后细胞凋亡与Con组相比,HR组Bcl-2/Bax比值显著降低（P<0.001）,而H₂组Bcl-2/Bax比值显著高于HR组（P<0.001）,提示H₂在心肌细胞HR后可通过升高Bcl-2/Bax比值而减少细胞凋亡。各组心肌细胞凋亡率分别为:Con 7.7±1.6%,HR 87.7±9.0%,H₂ 68.9±9.6%,其中H₂组显著低于HR组（P=0.024）,提示H₂可减少心肌细胞HR后细胞凋亡率。4、H₂影响心肌细胞HR后ERS,降低CHOP表达与Con组相比,HR组ERS相关蛋白CHOP表达显著升高（P<0.001）,而H₂组CHOP表达显著高于HR组（P<0.001）,提示H₂影响心肌细胞HR后ERS,降低CHOP表达水平。（二）H₂调节ERS-CaMKⅡ-Ca²⁺超载影响细胞凋亡机制研究1、CHOP介导H₂对心肌细胞CaMKⅡ氧化激活水平的影响与Con组相比,HR组ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值显著升高（P<0.001）,而H₂组ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值显著低于HR组（P<0.001）,提示H₂可降低细胞HR后CaMKⅡ氧化激活（即ox-CaMKⅡ）水平。当上调CHOP表达（即HR+Lv-CHOP组）,与HR组相比,ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值显著升高（P=0.002）,在此基础上再给予氢（即HR+Lv-CHOP+H₂组）,与HR+Lv-CHOP组相比,ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值降低（P<0.001）,但与HR组之间无统计学差异（P=0.163）;当下调CHOP表达（即HR+Lv-sh RNA组）,与HR组相比,ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值显著降低（P<0.001）,在此基础上再给予氢（即HR+Lv-sh RNA+H₂组）,与HR+Lv-sh RNA组相比,oxCaMKⅡ/CaMKⅡ比值显著降低（P<0.001）,且与H₂组无统计学差异（P=0.940）,提示CHOP介导H₂对CaMKⅡ氧化激活水平的影响。2、CaMKⅡ介导H₂对心肌细胞[Ca²⁺]i水平的影响与Con组相比,HR组[Ca²⁺]i水平显著升高（P<0.001）,而H₂组[Ca²⁺]i水平显著低于HR组（P<0.001）,提示H₂可降低细胞HR后[Ca²⁺]i水平。当KN-93抑制CaMKⅡ激活（即HR+KN-93组）,与HR组相比,[Ca²⁺]i水平显著降低（P<0.001）,在此基础上再给予氢（即HR+KN-93+H₂组）,与HR+KN-93组相比,[Ca²⁺]i水平显著降低（P=0.001）,且与H₂组无统计学差异（P=0.143）,提示CaMKⅡ介导H₂对[Ca²⁺]i水平的影响。3、CaMKⅡ介导H₂对心肌细胞凋亡的影响与HR组相比,HR+KN-93组Bcl-2/Bax比值显著升高（P=0.004）,而HR+KN-93+H₂组Bcl-2/Bax比值显著高于HR+KN-93组（P=0.030）,且与H₂组无统计学差异（P=0.372）,提示CaMKⅡ介导H₂对Bcl-2/Bax比值的影响。同样地,与HR组相比,HR+KN-93组细胞凋亡率显著降低（P<0.001）,而HR+KN-93+H₂组细胞凋亡率显著低于HR+KN-93组（P<0.001）,且与H₂组无统计学差异（P=0.272）,提示CaMKⅡ介导H₂对细胞凋亡率的影响。（三）H₂调节ERS影响细胞凋亡的在体验证研究1、H₂减少心肌IR后羟自由基（·OH）和过氧亚硝基阴离子（ONOO-）反映·OH水平的8-羟基脱氧鸟嘌呤（8-OHd G）在各组心肌中的阳性表达指数分别为:Sham 4.3±0.8%,IR 89.1±0.8%,H₂ 54.9±5.0%,其中H₂组显著低于IR组（P<0.001）;反映ONOO-水平的3-硝基酪氨酸（3-NT）在各组中的阳性表达指数分别为:Sham 9.7±0.8%,IR 86.7±5.2%,H₂ 63.4±7.4%,同样的,H₂组显著低于IR组（P<0.001）,提示H₂减少心肌IR中·OH和ONOO-的含量。2、H₂影响心肌IR后ERS,降低CHOP表达与Sham组相比,IR组CHOP表达水平显著升高（P<0.001）,而H₂组CHOP表达水平显著低于IR组（P=0.001）,证实H₂可调控ERS,降低心肌IR后CHOP表达。3、H₂降低心肌IR后CaMKⅡ氧化激活水平与Sham组相比,IR组ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值显著升高（P<0.001）,而H₂组ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值显著低于IR组（P<0.001）,证实H₂可降低心肌IR后CaMKⅡ氧化激活水平。4、H₂减少心肌IR后细胞凋亡与Sham组相比,IR组Bcl-2/Bax比值显著降低（P<0.001）,而H₂组Bcl-2/Bax比值显著高于IR组（P=0.003）,证实H₂在心肌IR后可通过升高Bcl-2/Bax比值而减少细胞凋亡。各组大鼠心肌细胞凋亡指数分别为:Sham 4.6±1.1%,IR 42.7±5.7%,H₂28.1±6.9%。其中H₂组显著低于IR组（P=0.001）,证实H₂可减少心肌IR后细胞凋亡数。5、H₂降低心肌IR后损伤各组大鼠血清中LDH含量分别为:Sham 2195.4±167.6 U/L,IR 4159.7±243.1 U/L,H₂ 3699.4±182.7 U/L,其中H₂组显著低于HR组（P=0.003）;各组大鼠血清中c Tn I含量分别为:Sham 35.4±3.5 ng/L,IR 150.5±18.4 ng/L,H₂ 121.6±13.8 ng/L,其中H₂组显著低于HR组（P=0.005）,证实H₂可减少心肌IR后损伤。6、H₂减少心肌IR后梗死面积与IR组相比,H₂组心肌梗死区面积/危险区面积（INF/AAR）显著降低（22.4±2.9vs 48.4±3.5%,P<0.001）,证实H₂可减少心肌IR后梗死面积。7、H₂改善心肌IR后心功能体现左心室心肌收缩能力的LVSP和+dp/dtmax在IR组均显著低于Sham组（92.4±6.3 vs 131.8±8.1 mm Hg,P<0.001;3601.2±339.6 vs 8563.4±514.6 mm Hg/s,P<0.001）,而H₂组的LVSP和+dp/dtmax较IR组显著提高（120.0±9.7 vs 92.4±6.3mm Hg,P<0.001;5801.0±816.8 vs 3601.2±339.6 mm Hg/s,P<0.001）,证实H₂可改善心肌IR后左心室心肌收缩能力,保护心功能。五、研究结论1、心肌IR能激活ERS,增加心肌细胞的凋亡;2、H₂可通过减轻心肌IR后ERS,下调CHOP表达,降低CaMKⅡ的氧化激活,减少细胞凋亡;3、H₂影响心肌细胞凋亡的具体机制与CaMKⅡ介导细胞内Ca²⁺超载有关。