论文部分内容阅读
利用从红树中分离到一株对多种病原物具有最强活性的解淀粉芽孢杆菌CIII-1,通过质粒消除确定具有抗菌活性的物质在染色体上。分析抗菌活性的物质及用生物信息学的方法预测解淀粉芽孢杆菌基因组中的基因,根据这些结果设计多对引物从CIII-1菌株中克隆出了5条序列,其中4条为目的基因。选择其中的2个基因Lci和BacE在原核表达系统中表达,测定了表达产物的抗菌活性。
采用SDS法反复多次处理菌株来消除质粒,比较质粒消除前后抗菌活性的变化,来确定抗菌活性物质基因的位置。用0.005%的SDS反复多次处理后,质粒被完全的消除掉了。比较质粒消除前后的抗菌活性,发现基本无变化。说明产生活性物质的基因在染色体上,而不在质粒上。测定了蛋白类抗菌活性物质的耐热性和蛋白酶敏感性,表明抗菌活性物质为耐热的,对蛋白酶不敏感的蛋白质,因此确定为抗菌肽。
利用6种广谱抗生素抗生素筛选CIII-1菌株的抗生素抗性,氨苄青霉素、红霉素、氯霉素、头孢霉素、利福平、四环素对CIII-1菌株的MIC分别为0.4μg/mL、1.6μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、0.4μg/mL和3.0μg/mL。利福平和氨苄青霉素对CIII-1菌株有较好的抑菌活性,可选作为基因敲击中的筛选标记。头孢霉素和四环素有可能与CIII-1菌株一起用于病害的防治。
通过抗菌肽数据库及信号肽的分析软件Signa13.0、SecretomeP1.0、TMHMM2.0等对解淀粉芽孢杆菌FZB42全基因组进行分析,预测结果显示,其基因组中存在大量编码抗菌肽和分泌蛋白的基因,选择SpsA、BacE、SrfAD、fenA和Lci等基因。根据预测的基因保守序列设计引物,用PCR的方法从解淀粉芽孢杆菌材料中扩增出了抗菌肽和分泌蛋白基因并测序。从菌株CIII-1中扩增出了5条片段,分别为200bp、1600bp、1027bp、698bp和802bp。克隆到T载体后,通过菌落PCR进行鉴定后,选取阳性菌落测序,除SpsA基因为非目标片段外,另外的4个片段均为目标基因,其中的三个基因具有完整读码框。与解淀粉芽孢杆菌FZB42基因组中相应基因相比,它们均存在碱基突变和相应的氨基酸变化。
选取其中的2个基因Lci和BacE在原核生物中进行蛋白融合表达。将Lci和BacE基因克隆到表达载体pET32a中,经测序分析,读码框架正确。经IPTG诱导表达后,Lci基因表达出约30KD的蛋白质,成功地表达出Lci基因。而BacE基因表达没有成功。测定Lci基因表达产物对多种病原物的抑制活性,结果表明它对病原细菌具有抑制活性,对病原真菌没有抑制活性。