论文部分内容阅读
半矮秆基因广泛用于大麦育种。迄今,已报导过30多种大麦矮秆基因。其中sdw1/denso半矮秆基因在欧美、澳大利亚等国家大量应用,是大麦育种中应用最成功的基因之一。而我国大麦矮秆育种上应用的主要基因是uzul基因。sdw1/denso基因在不同环境条件下能使株高降低10-20 cm。此外,该基因与迟抽穗、晚熟、降低千粒重和高过筛率相关。sdw1/denso基因对产量的影响因遗传背景而异。基于sdw1/denso基因适宜的株高和潜在的增产效应,故已被转入至许多大麦品种。目前,至少有4个sdw1/denso等位基因被先后报导。值得关注的是,denso基因主要用于啤酒大麦育种,而sdwl基因主要用于饲料大麦育种。综上所述,有必要克隆sdw1/denso基因,以阐明其矮秆机制,揭示该基因对农艺性状的影响,从而更好地应用于大麦育种。现将本文的主要研究及取得的结果介绍如下：1.大麦sdw1/denso候选基因的克隆比较基因组学表明,大麦sdw1/denso基因位于与水稻1号染色体sdl基因染色体存在共线性区域,而水稻sdl基因编码GA 20-氧化酶。通过PCR法在大麦中获得部分水稻sdl基因的同源序列,并将其命名为HvGA20ox2。利用获得的部分序列BLAST Gramene网站（http://www.gramene.org/）获得HvGA20ox2全长序列。通过比较,发现大麦HvGA20ox2与水稻sdl具有相同的基因结构,包含3个外显子和2个内含子。预测的HvGA20ox2蛋白序列与小麦GA20ox2b和粗山羊草的GA20ox2相似性分别达94.1%和95.7%。测序分析大麦denso品种Baudin和高秆品种AC Metcalfe的HvGA20ox2基因,发现了一个SNP标记和InDel标记。这两个标记在178个Baudin×AC Metcalfe DH株系中共分离,同时将HvGA20ox2基因定位于大麦3HL染色体。以上结果表明,sdw1/denso基因可能是水稻sdl的同源基因。HvGA20ox2基因的克隆有助于了解sdw1/denso基因的矮秆机制,并为sdw1/denso基因的筛选提供了诊断标记。2.HvGA20ox2基因的表达与大麦农艺和品质性状的关系半定量RT-PCR表明,HvGA20ox2基因在大麦各组织器官中都有不同程度的表达。denso基因型品种Baudin的叶片、叶鞘,茎、穗轴和幼穗中,HvGA20ox2基因的转录水平呈不同程度的降低。利用qRT-PCR检测Baudin x AC MetcalfeDH群体中HvGA20ox2基因的表达量并进行QTL定位分析,结果仅在3H染色体HvGA20ox2基因区域获得一个eQTL。研究还发现该eQTL与株高、产量、发育指数、容重和籽粒饱满度QTL重叠,表明可能是HvGA20ox2基因的多效性影响大麦农艺和品质性状。根据QTL定位和基因表达与性状的相关性分析结果表明,在Baudin x AC Metcalfe DH群体中,fIvGA20ox2基因低表达量除降低株高外,还提高产量。由于sdw1/denso基因与低粒重和高过筛率相关,同时该群体中高秆和矮秆品种的穗长相当,因此认为,该矮秆基因可能通过增加有效分蘖而提高产量。3. sdwl/denso等位基因的鉴定和功能分析PCR扩增sdw1l/denso突变体的HvGA20ox2基因,结果发现两个sdwl突变体Jotun和Riso no.9265中HvGA20ox2基因完全缺失。测序分析denso突变体的HvGA20ox2基因,发现其1号外显子中缺失7 bp （GACTCCC）.利用7 bp缺失设计了插入缺失分子标记InDel-der ISO,可以有效区分denso和sdwl突变体。利用该标记检测了535份大麦品种,结果发现denso基因已应用于我国甘肃和云南的大麦育种。此外,还获得一个鉴定d ns o和sdwl等位基因的基因表达标记（GEM）。通过检测HvGA20ox2基因的旁邻基因,发现两个不同来源的sdwl突变体Jotun和Riso no.9265缺失片段不同。Riso no.9265突变体中Morexcontig40861 （包括HvGA20ox2和Mloc56463基因）完全缺失。而Jotun突变体至少缺失包括Morexcontig40861在内的5个基因。因此,可用Morexcontig40861的旁邻基因鉴定Jotun和Riso no9265等位基因。上述HvGA20ox2基因在不同sdwl/denso突变体中的变异,进一步表明sdwl/denso就是HvGA20ox2基因。denso突变体中,7 bp缺失的HvGA20ox2基因内部还有一转录起始位点,可能编码产生一新蛋白,但仍然具有2-酮戊二酸和GA底物结合有关的保守序列。因此denso基因至少具有部分GA20-氧化酶的功能。相反,sdwl突变体中,HvGA20ox2基因完全缺失,表明突变体内缺失某一GA20-氧化酶。因此,可以认为denso突变体仍能广泛应用于啤酒大麦育种,可能是因为体内赤霉素含量的轻微变化不足以影响品质；而sdwl突变体由于体内赤霉素降低太多而只能用于饲料大麦育种。4. HvGA20ox2基因功能分析通过分析拔节期Bomi和突变体Risono.9265茎中GA双加氧酶的表达,发现突变体中HvGA20ox1和 HvGA3ox2基因的表达量明显上调,而HvGA2ox3基因的表达量明显下调。这可能是由于Riso no.9265突变体中HvGA20ox2基因缺失造成体内活性GA降低引起的。拟南芥中HvGA20ox2基因超表达引起赤霉素过量表型,特征是胚轴和茎伸长、早开花和高生长速率。此外大麦HvGA20ox2基因能使拟南芥半矮秆突变体ga5-3表型恢复。与对照相比,HvGA20ox2转基因拟南芥中GA含量增加,尤其是GA1+3。转基因拟南芥赤霉素含量的变化与表型的变化相应。研究还发现转基因拟南芥中AtGA20ox1、AtGA20ox2和AtGA3ox1基因表达量降低,而AtGA2ox2基因表达量增加,而ga5-3突变体正好相反,这可能是由于转基因植株中活性GA增加而ga5-3中活性GA降低引起的负反馈作用。这些结果表明,大麦HvGA20ox2与拟南芥AtGA20ox1基因同源,且在赤霉素合成途径中参与GA 20-氧化酶功能。另外,Riso no.9265突变体中HvGA20ox2基因缺失、抽穗期推迟,这可能是由于突变体内GA含量降低引起sdw1/denso突变体抽穗推迟。