1 研究背景 宫颈癌位居中国妇科恶性肿瘤的第二位,严重影响女性生育和生命健康。其主要组织学类型为宫颈鳞状细胞癌(鳞癌)(cervical squamous cell carcinoma,CSCC),发病率占75%~80%。宫颈癌的预后与临床分期密切相关,早发现和早治疗是改善患者预后的有效途径。流行病学调查显示与宫颈癌发病相关的因素主要包括:人乳头瘤病毒(human pappilloma virus,HPV)感染、性行为及分娩次数等。对高危人群的筛查是提升宫颈癌早期诊断率的重要手段。相关研究发现有宫颈癌家族史人群的一级亲属中患宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)Ⅲ级及浸润性宫颈癌的机率明显高于无宫颈癌家族史人群。随着对宫颈癌分子生物学研究的进展,发现遗传因素可能是宫颈癌发病因素的重要组成部分。宫颈鳞癌和食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是中国最为常见的两种恶性肿瘤,而且,二者在流行特征,发病危险因素,特别是组织学发生模式等方面具有明显的相似性。流行病学调查显示河南、山西和新疆石河子等食管癌高发区同时存在宫颈癌高发的现象。HPV感染已被证明与宫颈癌发生和发展密切相关;非常有趣的是,近年越来越多的研究提示,HPV感染能明显提高食管癌发病风险。宫颈与食管鳞癌的组织学发生均为多阶段进行性发展过程,即,正常鳞状上皮经基底细胞过度增生→不典型增生→原位癌→早期浸润癌。此外,食管癌变组织学发生名词多借鉴于宫颈癌组织学发生的命名原则。特别需要指出的是,近年肿瘤遗传分子生物学研究提示食管癌和其他肿瘤存在相似的基因单核苷酸多态易感位点(single nucleiotide polymorphism,SNP)。本研究组前期利用全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)所发现的中国人群食管鳞癌易感位点,被后来的研究证明与人体许多其他肿瘤也相关,包括胃癌、食管腺癌、肺癌、胆囊癌,甚至脑神经胶质瘤有关;近年有关肺鳞癌和胃癌GWAS研究又发现了一些重要易感位点。鉴于此,本研究旨在探讨中国汉族人群宫颈鳞癌患者临床表型特征及其与生存关系,并结合近年有关食管鳞癌、肺癌和胃癌GWAS发现的主要易感位点,利用Sequenom Mass Array分子量阵列技术甄别宫颈癌相关易感位点,进一步明确这些易感位点与宫颈癌临床表型的关系,加深对宫颈癌发病分子机理的了解。2资料与方法2.1宫颈鳞癌发病因素和生存影响因素分析2.1.1研究对象病例组来自郑州大学第三附属医院,河南省肿瘤医院和郑州市妇幼保健院2000年1月1日-2014年4月30日收治的宫颈鳞癌患者。宫颈鳞癌的患者入选标准:均经组织病理学证实为宫颈鳞状细胞癌。809例宫颈鳞癌患者平均年龄50±11岁(年龄范围:25~83岁);795例对照组均来自于郑州大学第三附属医院健康体检人群,平均年龄48±11岁(年龄范围:24~88岁)。2.1.2问卷调查流行病学调查采用问卷调查方式,内容包括:年龄、户籍类型、结婚年龄、吸烟史、孕产史、月经初潮年龄、绝经年龄、家族史等信息。2.1.3随访采用电话、家访等方法对患者进行随访,并结合当地村医对患者生存情况进行调查,将调查随访资料集中整理后输入EXCEL表格,以便于数据分析应用。2.1.4统计学分析所有信息录入EXCEL软件,SPSS17.0统计软件处理,组间比较采用卡方检验,Logistic回归分析,采用Kaplan-Meier绘制生存曲线,Log-Rank检验进行组间比较分析各因素与生存关系,COX-regression回归计算风险比例及95%可信区间,检验水准取α=0.05。2.2宫颈鳞状细胞癌易感位点研究2.2.1研究对象病例组来自郑州大学第三附属医院,河南省肿瘤医院和郑州市妇幼保健院2011年10月23日-2012年5月5日收治的宫颈鳞癌患者。宫颈鳞癌患者入选标准同前。376例宫颈鳞癌患者平均年龄53±11岁(年龄范围:25~83岁);731例对照组均来自于郑州大学第一附属医院健康体检人群,平均年龄51±11岁(年龄范围:18~80岁);女性对照组389例,平均年龄51±10岁(年龄范围:18~77岁);男性对照组342例,平均年龄51±11岁(年龄范围:19~80岁)。2.2.2血样收集和DNA提取采集每位病例组宫颈鳞癌患者和对照组健康人晨起空腹外周静脉血5ml,分装成5管,每管1ml,-80℃储存。采用Flexi Gene DNA提取试剂盒(Qiagen),并按照说明书中操作步骤提取血样品中的全基因组DNA,将用于验证的DNA浓度进行标准化,使浓度保持在15ng-20ng/ul,OD值范围为1.8-2.0。2.2.3基因型检测本研究检测的易感位点来自食管鳞癌、肺癌和胃癌GWAS研究所发现的18个SNPs,包括4个食管鳞癌、12个肺癌和2个胃癌SNP位点。根据这些SNP位点进行引物的设计,采用Sequenom Mass Array分子阵列技术,检测这些位点在病例组和对照组的变化。2.2.4统计学分析计算最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)以及哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg,HWE)平衡律,利用Plink 1.06软件对经过质控后数据进行分析,并采用Cochran-Armitage trend检验计算P值、95%可信区间(95%confidence interval,95%CI)以及优势比(odds ratio,OR)。比较验证每个SNP等位基因频率在病例组和对照组之间差异采用卡方检验,检验标准α=0.05。3 结果 3.1宫颈鳞癌发病风险3.1.1宫颈鳞癌患者发病年龄≤35岁、36~45岁、46~55岁、56~65岁和≥66岁所占比例分别为7.17%(58/809)、30.41%(246/809)、33.87%(274/809)、20.52%(166/809)和8.03%(65/809),提示宫颈鳞癌患者高发年龄为36~55岁。3.1.2宫颈鳞癌患者农村居民所占比例明显高于城市居民(510/809,63%VS.299/809,37%),提示社会经济地位低下是宫颈鳞癌发病的风险因素。3.1.3宫颈鳞癌患者月经初潮年龄<14岁所占比例明显低于对照组(195/804,24%VS.437/795,55%),提示初潮年龄晚明显影响宫颈癌发病风险(OR=0.262,95%CI 0.212-0.325,P=0.000)。3.1.4宫颈鳞癌患者结婚年龄<22岁所占比例明显高于对照组(315/767,41%VS.109/795,14%),提示早婚是宫颈癌发病风险又一重要影响因素(OR=4.386,95%CI 3.422~5.621,P=0.000)。3.1.5宫颈癌患者月经初潮年龄与结婚年龄时间间隔<8年所占比例明显高于对照组(368/767,48%VS.141/795,19%),提示结婚年龄与初潮年龄时间间隔短可以增加宫颈癌的发病风险(OR=3.999,95%CI 3.185~5.021,P=0.000)。3.1.6宫颈鳞癌患者妊娠次数≥3次所占比例明显高于对照组(621/805,77%VS.349/795,44%),提示妊娠次数多是宫颈癌发生的风险因素(OR=4.313,95%CI 3.475~5.353,P=0.000)。3.1.7宫颈鳞癌患者分娩次数≥2次所占比例明显高于对照组(643/805,75%VS.210/795,26%),提示多产与宫颈癌的发病风险相关(OR=11.057,95%CI8.754~13.966,P=0.000)。3.1.8宫颈癌不同发病风险影响因素Logistic回归分析发现:月经初潮年龄、早婚、多孕和多产是影响宫颈癌发生的独立风险因素。3.2宫颈鳞癌临床生存影响因素3.2.1单因素分析表明,分娩次数、FIGO分期和治疗方式与宫颈鳞癌患者预后密切相关(P<0.05);COX回归分析发现:FIGO分期不同是影响患者预后的独立风险因素(P<0.05)。3.2.2宫颈鳞癌Ⅰb~Ⅱa期患者生存影响单因素和COX回归分析提示:淋巴结转移阳性是影响患者预后的风险因素(P<0.05)。3.3宫颈鳞状细胞癌遗传易感性3.3.1宫颈鳞癌患者和女性对照组18个SNP位点对比分析发现rs36600 SNP位点明显提高宫颈癌发病风险(OR=0.68,95%CI 0.53~0.88,P=3.40×10-3),该位点定位在肌管素相关蛋白3(myotubularin related protein 3 MTMR3)基因上。为了鉴别对于女性特有疾病遗传易感性的研究是否可以把男性作为对照组,再次将宫颈鳞癌患者与男性对照组进行比较分析,结果两者无明显差异(OR=0.78,95%CI 0.60~1.03,P=0.08)。进一步将宫颈鳞癌患者与男女混合对照组进行分析验证,发现该SNP位点与宫颈鳞癌的发生仍然存在相关性(OR=0.73,95%CI 0.58~0.92,P=6.68×10-3)。3.3.2宫颈癌患者rs36600 SNP位点与生存预后相关性分析发现:携带不同基因表型患者的生存预后无明显差异(X2=0.000,P=0.985)。4 结论 4.1月经初潮年龄小是宫颈癌发生风险的保护性因素,而早婚、孕产次数多可能是宫颈癌发生的风险因素。4.2宫颈癌患者临床分期差异是影响生存预后的独立风险因素;淋巴结转移阳性影响Ⅰb~Ⅱa期宫颈鳞癌患者预后。4.3首次证实了与中国汉族人宫颈鳞癌发病明显相关的重要SNP位点,即位于22q12.2染色体上的MTMR3基因上的rs36600 SNP位点。