论文部分内容阅读
在机体中,骨骼肌占有相当大的比例并发挥着巨大的调控作用,因此,骨骼肌的生长发育不仅关系着畜禽机体的健康,还影响着畜禽生产性能的提高。另外,由于骨骼肌是机体巨大的蛋白周转代谢库,所以蛋白合成代谢及分解代谢决定着骨骼肌生长发育。本研究选择C2C12细胞（小鼠）、成肌细胞（鸡）及肉鸡作为研究对象,分别就糖皮质激素、一氧化氮（NO）及硫化氢（H2S）气体信号分子对骨骼肌发育的作用机制展开研究。第一部分:糖皮质激素对骨骼肌蛋白代谢的调控研究肌抑素（myostatin,MSTN）是肌肉生长发育的重要调控因子,影响着骨骼肌细胞内的蛋白合成及分解代谢。本研究利用地塞米松（DEX）处理C2C12细胞,初步探索肌抑素蛋白的表达规律。结果发现,DEX处理24 h后,肌抑素的mRNA丰度出现显著上调;当DEX处理36 h时,肌抑素的蛋白表达水平显著升高。同时,研究发现DEX处理显著抑制C2C12细胞的蛋白合成率及mTOR/p70S6K信号通路;而参与蛋白分解代谢的泛素蛋白酶体相关因子（FoxO1、FoxO3a及MURF1、Atrogin-1）得到激活。因此,我们推测肌抑素参与了C2C12细胞的蛋白合成及分解代谢。试验接下来采用肌抑素抑制剂（Follistatin,Fs）处理,在培养并分化的C2C12细胞中,同时加入DEX及肌抑素抑制剂处理。结果表明,肌抑素抑制剂处理能够显著抑制DEX对肌抑素的激活以及蛋白分解相关因子的激活,而对蛋白合成率及mTOR、p70S6K的作用不显著。总之,在骨骼肌发育早期阶段,糖皮质激素依赖于肌抑素促进骨骼肌蛋白分解代谢,影响骨骼肌的生长发育;并且,肌抑素不是糖皮质激素抑制蛋白合成代谢的关键因子。第二部分:气体信号分子NO骨骼肌蛋白代谢的调控机制研究气体信号分子NO参与机体多种生理活动,如血管平滑肌的舒张等,对机体的正常运转发挥着重要作用,而精氨酸是内源性NO的重要前体物质,因此,本研究对L-Arg-NO途径在骨骼肌蛋白代谢中的调控作用进行了研究。C2C12细胞:首先,L-Arg处理不仅显著缓解DEX处理对骨骼肌细胞的蛋白合成抑制作用,同时,相比于对照组,L-Arg处理能够显著上调C2C12细胞的蛋白合成率、mTOR（Thr 2446）和p70S6K（Thr 389）的磷酸化水平。其次,L-NAME（NOS抑制剂）处理能够显著抑制C2C12细胞的蛋白合成率、mTOR（Thr 2446）和p70S6K（Thr 389）的磷酸化;而L-Arg的添加能够缓解L-NAME对蛋白合成率、mTOR（Thr 2446）和p70S6K（thr389）磷酸化水平的抑制作用。另外,研究发现l-name能够显著抑制no的产生及tnos的活性,并且l-arg能够缓解了l-name对no产生的抑制作用。因此,我们推测l-arg-no途径参与了C2C12细胞的蛋白合成代谢过程。最后,研究采用snp（no供体）处理C2C12细胞,no能够促进骨骼肌蛋白合成代谢,通过激活p-mtor（thr2446）、p-p70s6k（thr389）及p-4e-bp1（thr37/46）相关因子的表达;另外,snp处理后,细胞及培养基内no的浓度显著升高。总之,在C2C12细胞上,精氨酸依赖于no气体信号分子,激活mtor/p70s6k信号通路促进蛋白合成代谢;另外,骨骼肌蛋白合成代谢的激活依赖于p-mtor（thr2446）的磷酸化而不是p-mtor（ser2448）和p-mtor（ser2481）。成肌细胞（鸡）:研究发现,不同浓度的l-arg处理均能一定程度地抑制成肌细胞蛋白合成率。同时,l-arg（400μm）处理组蛋白合成率及p70s6k的磷酸化显著下调,蛋白分解相关因子murf1及atrogin-1也受到显著抑制。并且,在l-arg处理下,添加l-name处理能够显著缓解l-arg对成肌细胞（鸡）蛋白合成及分解代谢的抑制作用。因此,我们猜测l-arg-no途径参与了成肌细胞（鸡）蛋白合成及分解代谢过程。最后,试验采用snp处理成肌细胞（鸡）,结果表明,snp通过抑制p70s6k的磷酸化,显著抑制骨骼肌蛋白合成代谢,同时,显著地抑制了蛋白分解相关因子的表达。总之,在成肌细胞（鸡）中,l-arg依赖于no气体信号分子对蛋白合成及分解代谢呈现显著的抑制作用。肉仔鸡:在上述细胞试验中,l-arg-no途径均参与了骨骼肌的蛋白代谢过程。因此,本研究假设了l-arg-no途径同样参与肉仔鸡的骨骼肌蛋白合成代谢过程。试验首先研究了l-name处理对肉仔鸡生产性能的影响,结果表明,l-name（0.05%）能够显著抑制肉仔鸡日增重及空肠、回肠的发育;而对胸肌及其指数无显著影响,腿肌重量呈现下调的趋势但腿肌指数无显著变化。接着,研究采用日粮添加1%l-arg处理,结果表明,精氨酸能够显著缓解l-name对肉鸡的日增重及肉仔鸡胸、腿肌重的抑制,而对胸、腿肌指数的影响不显著;同时,l-arg一定程度缓解了l-name对胸肌蛋白合成率及mtor、p70s6k的抑制作用,除p70s6k的磷酸化外,均不显著;而在腿肌中,l-arg显著上调了蛋白合成率、mtor、p70s6k蛋白水平。最后,进行了吗多明（no供体）处理肉仔鸡试验,结果表明,吗多明处理能够显著缓解l-name对肉鸡的日增重及回肠发育的抑制作用,而对胸腿肌发育作用不显著;在胸腿肌中,吗多明处理显著缓解了l-name对蛋白合成率、mtor、p70s6k蛋白水平上的抑制作用。总之,在肉仔鸡中,精氨酸至少部分依赖于NO气体信号分子调控肉鸡生长发育;并且,在此过程中,肉仔鸡的生长发育并不主要依赖于骨骼肌的生长发育。第三部分:气体信号分子H2S对骨骼肌蛋白合成代谢调控机制的研究硫化氢（H2S）是机体内重要的气体信号分子,能够参与众多疾病的发生、发展及痊愈等过程,其具有重要的生理学意义。本研究首先利用DEX处理成肌细胞（鸡）建立蛋白合成下调模型,添加RU486处理能够显著阻断DEX对成肌细胞（鸡）蛋白合成代谢的抑制作用,这表明DEX通过糖皮质激素受体（GR）对蛋白合成代谢进行相应的调控;而添加L-Cys处理能够显著缓解DEX对mTOR/p70S6K信号通路、蛋白合成率、CSE（胱硫醚-γ-裂解酶）的抑制作用。另外,在L-Cys处理下,添加PAG（CSE抑制剂）处理能够显著抑制成肌细胞（鸡）的蛋白合成率、mTOR、p70S6K的磷酸化及CSE的蛋白表达。因此,我们推测H2S参与了成肌细胞（鸡）蛋白合成代谢过程。试验接着检测了NaHS（H2S供体）对成肌细胞（鸡）蛋白合成代谢的调控,结果发现,NaHS处理能够显著升高培养基内H2S的浓度;并且,显著缓解了DEX对mTOR/p70S6K信号通路、蛋白合成率、CSE的抑制作用。最后,为了进一步证明H2S对蛋白合成代谢的调控作用,试验采用Insulin处理建立蛋白合成代谢上调模型,Insulin处理显著上调成肌细胞（鸡）蛋白合成代谢并呈剂量依赖性;添加PAG处理能够显著抑制Insulin对成肌细胞（鸡）的蛋白合成率、mTOR、p70S6K的磷酸化及CSE蛋白表达的激活作用。总之,糖皮质激素及胰岛素依赖于CSE/H2S,调控mTOR/p70S6K信号通路影响骨骼肌蛋白合成代谢过程。总之,（1）在生长发育早期,肌肉生长抑制素信号通路参与了糖皮质激素诱导的骨骼肌蛋白分解代谢。（2）在C2C12细胞中,L-Arg-NO促进骨骼肌细胞的蛋白合成代谢;在成肌细胞（鸡）上,L-Arg-NO抑制了肌细胞的蛋白合成及分解代谢;在肉仔鸡上,L-Arg-NO调控肉仔鸡的生产性能不是直接通过促进骨骼肌的生长发育实现的。（3）糖皮质激素及胰岛素依赖于CSE/H2S,激活mTOR/p70S6K信号通路,促进骨骼肌蛋白合成代谢过程。