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黄曲霉毒素在发展中国家是最重要的健康杀手,它是由黄曲霉和寄生曲霉的产毒菌株所生成,并对生长期的家禽(尤其是雏鸭和火鸡)、幼猪、怀孕母猪、犊牛和犬产生影响。相对而言,成年牛、绵羊和山羊对急性的黄曲霉毒素中毒抵抗力较强,但如果长期从食物中摄入也可能引起中毒。硒是日常饮食中广泛存在的一种含量很低但是必不可少的矿质元素,由于其具有的许多独特而新颖的营养学、生物化学及分子生物学特性,使之成为营养学研究中一个被持续关注的热点。含有硒的抗氧化硒蛋白GPX1主要作用是抗氧化应激,这也使得硒成为具有抗氧化特性的一种重要微量营养素。β-胡萝卜素是效力最强的的维生素A原(即类胡萝卜素),具有发挥抗氧化特性的能力。它可以在脂质阶段通过减少自由基来发挥其抗氧化功能。它是一种有效的抗氧化剂,可以通过猝灭纯态氧、过氧自由基,抑制脂质过氧化来发挥其在脂质系统中的抗氧化作用。研究的目的：本文专注于两项研究。第一项研究是探讨AFB1在MDCK细胞上诱导细胞毒性和氧化应激的潜力,硒(蛋氨酸和亚硒酸钠)对AFB1诱导的氧化应激的保护潜力,而且也比较了有机硒(硒蛋氨酸)和无机硒(亚硒酸钠)的抗氧化潜力。第二项研究探讨AFB1在MDCK细胞上诱导致细胞病变、氧化应激和细胞凋亡的潜力以及p-胡萝卜素对AFB1诱导的氧化应激和细胞凋亡的保护潜力。方法：MDCK细胞培养于DMEM,培养基中补充有10%的血清和1%的抗生素(10,000IU/ml青霉素和10,000μg/ml的链霉素,Gibco),细胞在37℃、加湿环境中培养。细胞长满后用胰蛋白酶消化分离,并根据需要进行重悬。在第一项研究中,细胞培养在94(用于MTT),24(用于LDH, GSH)和6(用于MDA, GPX1的活性及mRNA)孔板。培养24小时后更换为含有不同剂量和不同形式硒(硒蛋氨酸或亚硒酸钠)的新培养基,继续培养24小时,然后再换上含0.25μg/ml AFB1 (1mg/ml的浓度溶解于DMSO中)的新培养基,并继续培养48小时。在只用硒的实验中,细胞培养24小时后,更换成含有硒的培养基并继续培养24小时。试验分为以下几组：A(阴性对照,细胞不加任何刺激剂),B(毒素对照,力口0.25μg/ml毒素),C(0.2μM硒+0.25μg/ml毒素),D(0.8μM硒+0.25μg/ml毒素),E(1μM硒+0.25μg/ml毒素),F(2μM硒+0.25μg/ml毒素),G(4μM硒+0.25μg/mll毒素)和H(8μM硒+0.25μg/ml毒素)。在只含硒的试验中,硒浓度都是相同的但是不加毒素。在第二项研究中,细胞培养在94(用于MTT),24(用于GSH)和6(用于MDA, caspase-3活性和Bcl-2的mRNA)板。用于细胞病理学检查的细胞培养在玻璃盖玻片上(预先涂有聚-L-赖氨酸)。试验分为以下几组：A(对照,细胞不加任何刺激剂),B(毒素对照,0.25μg/ml毒素),C (0.05μM β-胡萝卜素+0.25μg/ml毒素),D(0.1μM β-胡萝卜素+0.25μg/ml的毒素),E(0.2gμM β-胡萝卜素+0.25μg/ml毒素),F (0.胡萝卜素+0.25μg/ml毒素)和G (0.8μM β-胡萝卜素+0.25μg/ml毒素)在只含有β-胡萝卜素的试验中,β-胡萝卜素的浓度都是相同的但不加毒素。培养结束后,试验样本根据各个检测的要求进行制备。比如做GSH,MDA和GPX1活性的检测时要通过超声裂解法制备细胞裂解物,MTT检测可以用细胞分光光度法直接进行检测,细胞外LDH的检测需要收集培养基。对于GPX1和Bcl-2 mRNA的检测,cDNA要根据试剂盒的说明书来制备。结果：结果表明AFB1对MDCK细胞的毒性作用具有剂量和时间依赖性。AFB1的半数最大中毒浓度(IC50)为0.25μg/ml。因此,接下来的试验中AFB1的浓度均使用0.25μg/ml。第一项研究的结果表明,0.25μg/ml的AFB1会导致显著的氧化应激,具体表现在与对照组相比,丙二醛(MDA)水平显著增加,细胞内GSH水平显著降低,以及GPX1活性和mRNA水平显著降低。硒蛋氨酸能够对AFB1诱导的氧化损伤起到保护作用,且这种作用具有剂量依赖性。当硒蛋氨酸的浓度在1μM到4μM之间时,保护作用较好。在这一范围内,MDA含量显著下降,而细胞内GSH水平,GPX1活性和mRNA水平都显著提高。此外,细胞存活率显著改善。但是,当使用亚硒酸钠时,只有较低浓度的亚硒酸钠可以保护细胞免受AFB1诱导的细胞损伤,而较高浓度的亚硒酸钠可作为促氧化剂,添加了较高浓度亚硒酸钠的试验组造成的细胞损伤比只加毒素组更严重。第二项研究的结果表明,0.25μg/ml的AFB1会导致显著的氧化应激,表现在丙二醛(MDA)水平显著增加,细胞内GSH水平显著降低。Bcl-2表达量的降低和caspase-3活性的增强(标记物广泛用于检测细胞凋亡)表明了受到氧化应激的细胞正在凋亡。AFB1处理后的细胞凋亡在MDCK细胞玻片的病理学检查中被证实。AFB1的使用导致了细胞数目的减少,并且有蛋白变形和细胞膜破裂等损伤。五个浓度的β-胡萝卜素被用于对抗AFB1的IC50剂量。β-胡萝卜素的使用可以对AFB1诱导的氧化应激和细胞凋亡起到显著的保护作用。当细胞预先用β-胡萝卜素处理后,MDA水平和caspase-3活性显著下降,而Bcl-2表达水平和细胞内GSH水平显著提高。此外,细胞存活率显著改善。β-胡萝卜素对抗AFB1的保护作用也可以通过细胞玻片的病理学检查证实。结论：1.黄曲霉素处理导致MDCK细胞的氧化应激参数的改变。2.硒能通过降低MDA水平,提高GSH水平和细胞中GPX1活性来有效保护受到氧化应激的细胞。3.相比无机硒(亚硒酸钠),有机硒(硒蛋氨酸)在避免氧化应激上是更强大的抗氧化剂。4.使用无机硒应当特别小心,因为超过生理极限的浓度会使其具有毒性。5.AFB1造成的氧化应激可以促进MDCK细胞的凋亡。6.AFB1造成的细胞凋亡是由caspase-3活性的增高和Bcl-2表达量的降低造成的。7.β-胡萝卜素是一种强有力的抗氧化剂,可以保护由AFB1诱导的氧化应激和细胞凋亡。