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目的:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)基因突变是导致病毒耐药的基础，虽然测序技术已广泛应用于HBV耐药突变检测，但其较低的灵敏度大大限制了其临床应用价值；反向杂交的灵敏度较高，约为5％，但其价格较贵，操作不够简便，尤其在发展中国家无法全面推广；一些新的技术，如质谱分析、超深度测序和高通量测序等技术逐渐得以应用，但是这些技术存在价格昂贵、操作繁琐、数据分析工作量大、存在碱基错配等缺点，较适合于研究目的，不太适合于临床应用。为了克服以上方法的缺点，建立高灵敏度、简便、价廉和实用的HBV耐药突变检测方法，本研究建立了低变性温度共扩增PCR (coamplification at lowerdenaturation temperature polymerase chain reaction, COLD-PCR)法并联合Sanger测序技术，将其应用于HBV已知和未知的耐药突变检测。方法:1.根据HBV逆转录酶区(reverse transcriptase, rt)的常见突变位点，设计可同时扩增野生株和突变株HBV rt180～rt215序列的引物，通过改变PCR条件(主要是变性温度)，确定产物关键变性温度(critical denaturation temperature, Tc)，以富集突变株。2.建立以Tc作为变性温度的Fast COLD-PCR及Full COLD-PCR (比前者增加了杂交过程，可富集所有的突变类型)/Sanger测序法，与常规PCR/Sanger测序法相比较，确定两种方法检测突变株的灵敏度、最低检出限及特异性。3.采用上述方法分别检测30例发生长期服用抗病毒核苷(酸)类似物(nucleos(t)ide analogues, NAs)，并且发生病毒学突破的慢性乙型肝炎(ChronicHepatitis B, CHB)患者的HBV基因突变，比较其突变株类型及其检出率。结果:1.常规PCR/Sanger测序对所有类型突变株的检出灵敏度均为10％(突变型:野生型比例为1:10，下同)。对于单一位点的突变类型，当发生熔解温度(meltingtemperature, Tm)下降的突变(如C:G→T:A等)时，Fast COLD-PCR对突变株的检出灵敏度达1%，Full COLD-PCR则为2%；对Tm不变或升高的突变(如C:G→G:C或T:A→C:G等)，仅有Full COLD-PCR可提高对突变株的灵敏度为2%。对于多位点突变类型，Fast COLD-PCR与Full COLD-PCR法检出突变的灵敏度可进一步提高为0.5%和1%。2. Fast COLD-PCR/Sanger测序法对不同突变类型的检测浓度有所不同，对突变株DNA的最低检出限可从5.0E+01IU/ml~1.0E+03IU/ml不等；FullCOLD-PCR/Sanger测序法对单一突变类型的检测浓度大致相同，突变DNA浓度约≥5.0E+02IU/ml时即可检出，对混合突变类型时最低检出限可提高至1.0E+02IU/ml。3.30例CHB患者常规PCR/Sanger测序法均未检出HBV基因突变；COLD-PCR/Sanger测序法共检出混合突变21例，其中Fast COLD-PCR/Sanger测序法检出17例突变(5例rtA181T+rtM204I，3例rtA181T，3例rtM204I，2例rtV191I，2例rtH197H，1例rtQ182Q+rtV191I，1例rtM204I+rtK212K)，FullCOLD-PCR/Sanger测序法检出14例突变(4例rtM204I，2例rtV191I，1例rtA181T，1例rtH197H，2例rtS189S+rtM204I，1例rtA181T+rtM204I，1例rtA180T+rtM204V，1例rtQ182Q+rtV191I，1例rtS213S）。结论:联合Fast/Full COLD-PCR与Sanger测序技术，能够显著提高大量野生型HBV DNA背景中的少量突变型DNA的检出能力，能够一次检出已知和未知的耐药突变位点，该技术简便、实用、价廉，适合与一般临床基因扩增实验室推广应用，对与HBV耐药的管理具有重要意义。