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2006年以来,由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)引起的严重型猪繁殖与呼吸综合征(Atypical PRRS)给我国养猪业造成了难以估量的经济损失。HP-PRRSV可导致感染猪的高发病率和高死亡率,其基因组的特征为Nsp2编码区存在不连续的30-aa缺失。因此,分析HP-PRRSV致死性毒力的相关基因对于阐明其致病性的分子机制具有重要的科学意义。已有的研究表明,HP-PRRSV Nsp2编码区30-aa缺失与其致死性毒力无关,而ORF1b编码区与其增殖能力和致病性增强密切相关。本论文利用反向遗传操作技术,分别以高致病性毒株JXwnO6和低致病性毒株HB-1/3.9为骨架,构建一系列在ORF1b编码区中4个非结构蛋白基因(Nsp9、Nsp10、Nsp11、 Nsp12)相互单独置换或组合置换的感染性cDNA克隆,并拯救出嵌合病毒；进一步系统分析嵌合病毒在MARC-145细胞和原代PAMs上的体外增殖特性及对仔猪的致病性,以期发现和确定HP-PRRSV致死性毒力相关的基因,为深入研究其致病机制提供科学依据。以高致病性毒株JXwn06和低致病性毒株HB-1/3.9的感染性cDNA克隆(pWSK-JXwn和pWSK-HB-1/3.9)为骨架。利用融合PCR将扩增得到的HB-1/3.9和JXwn06的非结构蛋白Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12、Nsp9+Nsp10、Nsp9+Nsp10+Nsp11基因片段分别拼接到pWSK-JXwn的C片段和D片段、pWSK-HB-1/3.9的D片段和E片段中,构建pEB-JC、pEB-JD、pEB-HD和pEB-HE中间质粒。经双酶切分别构建出以pWSK-JXwn为骨架,其Nsp9、Nsp10、Nsp11、Nsp12、 Nsp9+Nsp10、Nsp9+Nsp10+Nsp11分别被HB-1/3.9相应区域置换的嵌合cDNA克隆——pWSK-JHn9、pWSK-JHn10、pWSK-JHn11、pWSK-JHn12、pWSK-JHn9n10、 pWSK-JHn9n10n11,和以pWSK-HB-1/3.9为骨架,其相应的非结构蛋白基因分别被JXwn06相应区域置换的嵌合cDNA克隆——pWSK-HJn9、pWSK-HJn10、pWSK-HJn11、pWSK-HJn12、 pWSK-HJn9n10、pWSK-HJn9n10n11。经质粒线化、体外转录和转染细胞,拯救出嵌合病毒,并经间接免疫荧光及序列测定鉴定。拯救病毒分别命名为RvJHn9、RvJHn10、RvJHn11、RvJHn12、 RvJHn9n10、RvJHn9n10、11; RvHJn9、RvHJn10、RvHJn11、RvHJn12、RvHJn9n10、RvHJn9n10n11。分析嵌合病毒在MARC-145细胞和原代PAMs上的增殖动态,并与亲本拯救病毒RvJXwn、 RvHB-1/3.9进行比较。结果表明,在MARC-145细胞上,RvJHn9的病毒滴度始终低于亲本病毒RvJXwn,且在60h-96h差异显著(P<0.05; P<0.01); RvJHn10的增殖速度低于RvJXwn,但无显著差异；RvJHn9n10及RvJHn9n10n11的增殖速度也均明显低于RvJXwn,于多个时相差异显著(P<0.05；P<0.01)。在原代PAMs上,RvJHn9、RvJHn10、RvJHn9n10和IRvJHn9n10n11的增殖速度均低于亲本病毒RvJXwn,虽无显著差异,但后二者到达增殖峰的时间及峰值滴度均明显低于亲本病毒；而RvJHn11与RvJHn12的增殖动态与亲本病毒相似。在MARC-145细胞上,RvHJn9、 RvHJn10、RvHJn11和RvHJnl2的病毒滴度在多个时相均显著低于亲本病毒RvHB-1/3.9; RvHJn9n10的增殖速度虽慢于RvHB-1/3.9,但仅在12h病毒滴度差异显著(P<0.05);RvHJn9n10n11的增殖动态与亲本病毒RvHB-1/3.9相似,且峰值稍高于亲本病毒。在原代PAMs上,RvHJn9的增殖速度始终高于亲本病毒RvHB-1/3.9,且提早12h到达病毒滴度峰值,但无显著差异；RvHJn10在多个时相的病毒滴度高于亲本病毒,但无显著差异；而RvHJn9n10与RvHJn9n10n11的病毒滴度在12h-60h极显著高于亲本病毒RvHB-1/3.9(P<0.001),并且病毒滴度峰值为亲本病毒的10倍；RvHJn11与RvHJnl2的增殖动态与亲本病毒相似。上述结果说明,单独置换成HB-1/3.9的Nsp9或Nsp10能降低RvJXwn的增殖能力,且同时置换Nsp9+Nsp10能显著降低RvJXwn的体外增殖能力；相反,同时置换成RvJXwn的Nsp9+Nsp10则能显著提高RvHB-1/3.9的体外增殖能力。由此表明HP-PRRSVORF1b编码区中Nsp9和Nsp10基因与其体外增殖能力密切相关。以2×105TCID50/mL病毒滴鼻感染6周龄的健康仔猪(每组5头),对各嵌合病毒的致病性进行系统分析,并与亲本病毒进行比较。结果表明,RvJHn10及亲本高致病性毒株RvJXwn感染组均呈现严重的临床症状,死亡率均为5/5；RvJHn9感染组发病进程减慢,死亡率为3/5；RvJHn9n10与RvJHn9n10n11感染组仅表现短暂的体温升高,咳嗽喷嚏,临床记分极显著低于其它三个感染组(P<0.01；P<0.001),死亡率为0/5。此外,RvJHn9n10与RvJHn9n10n11感染组的日增重也显著高于其它三个感染组(P<0.05;P<0.01；P<0.001)。并且RvJHn9n10与RvJHn9n10n11在感染猪体内的增殖能力均极显著低于RvJXwn (P<0.001),血清中N蛋白抗体阳转时间明显延迟,抗体水平显著降低(P<0.01：P<0.001),肺脏病变评分及PRRSV抗原阳性信号也均显著低于RvJXwn感染组(P<0.01)。另一方面,亲本低致病性毒株RvHB-1/3.9及RvHJn10感染组均仅表现轻微的呼吸道症状,夕亡率均为0/5；而RvHJn9感染组的死亡率为1/5；RvHJn9n10与RvHJn9n10n11感染组体温明显升高(41℃),且伴随严重的临床症状,感染后9d至18d的临床记分显著高于RvHB-1/3.9和RvHJn10感染组(P<0.05；P<0.01；P<0.001),夕死亡率分别为3/5、2/5。此外,RvHJn9n10与RvHJn9n10n11感染组的日增重一直低于RvHB-1/3.9及RvHJn10感染组,且在感染后7d、14d差异显著(P<0.05；P<0.001),血清病毒载量也于感染后3d、5d、7d显著高于RvHB-1/3.9感染组(P<0.05；P<0.01),N蛋白抗体阳转时间明显提前,抗体水平显著高于RvHB-1/3.9感染组(P<0.01). RvHJn9n10与RvHJn9n10n11感染组死亡猪的肺脏病变与高致病性毒株RvJXwn感染组死亡猪相似,呈现严重的间质性肺炎,存活猪的肺脏也呈现弥散性病变;并且RvHJn9n10n11感染组的肺脏病变和组化染色评分均显著高于RvHB-1/3.9感染组(P<0.05)。上述结果表明,以高致病性毒株RvJXwn为骨架,其Nsp9+Nsp10编码区被低致病性毒株置换,病毒在感染猪体内的增殖能力和致死性毒力显著降低；相反,以低致病性毒株RvHB-1/3.9为骨架,其Nsp9+Nsp10编码区被高致病性毒株置换,病毒在体内的增殖能力和对猪的致病性显著升高,呈现对猪的致死性毒力。由此表明,ORF1b编码区中的Nsp9和Nsp10基因是我国HP-PRRSV的致死性毒力决定区。综上所述,我们的研究结果表明,我国HP-PRRSV ORF1b编码区中Nsp9和Nsp10基因不仅与其体内外增殖能力密切相关,而且是HP-PRRSV的致死性毒力决定基因,同时也表明HP-PRRSV的复制效率和增殖能力是决定其致病性和毒力的一个重要因素。研究结果为阐释我国HP-PRRSV的致病机制提供了重要的科学依据。