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黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco),隶属鲶形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黄颡鱼属(Pelteobagrus),是我国重要的经济鱼类之一。黄颡鱼为雌雄异体两性生殖鱼类,其雌雄生长速率差异明显,YY超雄黄颡鱼的培育为其XX♀/XY♂性别决定类型理论提供了有力的支持;Pf62-Y和Pf62-X作为黄颡鱼一对性染色体连锁标记,已被运用于黄颡鱼的全雄培育与生产,然而由于这对性别连锁SCAR标记在实际生产运用上有一定的局限性,为了寻找更多更高效准确的标记,以及探索黄颡鱼性别标记所在的性染色体及性别相关基因,我们展开了一系列的研究工作。 利用染色体步移技术,我们获得了黄颡鱼性连锁标记Pf62-Y8kb和Pf62-X5kb基因组序列,序列比对分析结果展现了两者之间显著的遗传差异与分化,在此基础上设计开发了3对新的高效稳定的性别连锁标记:Y1,X1和XY1,通过在黄颡鱼人工养殖群体以及收集的5个不同地理野生群体中的检测和验证,体现出我们新发展的标记的高效性与稳定性,为黄颡鱼遗传性别的鉴定及全雄黄颡鱼性控育种提供了扎实的技术支撑。 为进一步探索黄颡鱼的性染色体及性别决定机理,寻找性别分化相关基因,我们建立了高质量的黄颡鱼BACDNA文库,该文库一共含有80640个克隆,保存于210个384孔板中,平均插入的黄颡鱼基因组片段大小为128 kb,文库空载率<2.5%,覆盖率约为10.5倍的基因组。我们以Pf62-Y标记为出发点,经过两个水平筛选工作获得了7个阳性克隆,我们选取其中#76号克隆进行了BAC全长测序,利用Pf62-Y-BAC进行染色体荧光原位杂交(BAC-FISH)实验,将Pf62-Y定位于黄颡鱼的性染色体,证实了其性染色体的存在,后续结合染色体微分离等手段进一步对其展开研究,为其性染色体的进化及性别决定相关基因的研究提供更多的方向。 结合黄颡鱼性腺转录组数据库,我们从所测的BAC序列中分析比对得到一个含有PDZ结构域的转录本comp147485_c2_seq5,并将其初步命名为inad like基因。通过组织RT-PCR分析发现其mRNA高量表达于精巢组织,然后我们制备YC-inad like多克隆抗体,并在黄颡鱼精巢切片研究其蛋白表达分布情况,免疫组化结果显示INADL主要分布于精原细胞、初级和次级精母细胞。通过Crispr/Cas9基因敲除系统,我们在黄颡鱼中对该基因进行了敲除以探索其在黄颡鱼性腺分化过程的作用,目前筛选得到了突变型P0代;同时,我们对斑马鱼中的同源基因zf-inad like展开了平行研究,通过Cas9系统敲除zf-inadl基因研究其功能,已获得F3代纯合子,从外观上暂未观察到直观表型,仍需进一步的组织切片检测进行更深入的研究。