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目的 碘是人体必不可少的微量元素，是甲状腺激素（thyroidhormone，TH）合成的重要原料。碘缺乏是引起中枢神经系统发育障碍的最常见原因。碘缺乏除能够引起甲状腺功能减退外，更多的是导致低甲状腺素血症的发生。低甲状腺素血症表现为血清中游离甲状腺素（freethyroxine，FT4）降低，而游离三碘甲状腺原氨酸（freetriiodothyronine，FT3）和促甲状腺激素(thyroidstimulatinghormone，TSH)不变。轻度碘缺乏被公认为是母体和新生儿发生低甲状腺素血症的最常见原因。母体低甲状腺素血症能增加子代神经发育障碍的风险，造成子代不可逆的中枢神经系统损伤。大鼠小脑是研究TH影响脑发育的良好模型。颗粒细胞和浦肯野细胞是小脑中两种重要的神经元。这两种神经元以及他们之间的突触能否正常发育最终会影响小脑的形态和功能，从而影响精神运动和动作学习功能。母体孕期和哺乳期轻度碘缺乏所致的低甲状腺素血症对后代的神经系统发育及精神运动和动作学习功能损伤机制尚不清楚，其对脑发育过程中子代小脑颗粒细胞前体增殖和浦肯野细胞树突生长及颗粒细胞平行纤维-浦肯野细胞突触发育的影响作用如何也有待研究。本研究在母鼠孕期和哺乳期采用轻度碘缺乏饮食建立低甲状腺素血症模型，研究仔鼠小脑发育过程中颗粒细胞前体增殖以及浦肯野细胞树突生长的改变及其影响机制;并探究仔鼠小脑颗粒细胞平行纤维和浦肯野细胞树突间的突触发育变化及其影响机制，以期在蛋白分子和信号转导水平上阐明孕期和哺乳期轻度碘缺乏所致低甲状腺素血症损害后代神经发育及精神运动和动作学习功能的机制。 实验方法 一、实验动物与分组 健康雌性Wistar大鼠，按体重随机分成4组:对照组、轻度碘缺乏组、重度碘缺乏组和MMZ组，各组均饲以缺碘地区粮食配制的饲料，饮用加入不同剂量KI的去离子水，4组雌鼠每日总碘摄入量依次为:7.0μg/d、3.0μg/d、1.5μg/d和7.0μg/d。雌鼠饲养3个月后，交配妊娠。各组取孕鼠20-21只，至妊娠0天(gestationalday，GD0)开始直至仔鼠生后21天(postnatalday，PN21)，对照组、轻度碘缺乏组、重度碘缺乏组饮食同前，MMZ组在饮水中加入0.02％MMZ。 二、仔鼠血清FT4、FT3、TSH测定 分别于仔鼠PN7、PN14和PN21时，心脏采血，5000rpm离心10min，分离血清。采用固相化学免疫发光法测定血清中FT4、FT3、TSH含量。 三、仔鼠小脑颗粒细胞前体增殖的形态学研究 分别于PN7、PN14和PN21时每组取5只仔鼠，4％多聚甲醛灌流固定小脑，石蜡包埋，切片。在PN7、PN14和PN21时，小脑外颗粒细胞层Ki67和PCNA免疫荧光组织化学染色，观察仔鼠小脑颗粒细胞前体增殖形态学改变。用图像分析系统及图像分析软件分析小脑各蛋白表达的荧光平均强度。 四、仔鼠小脑颗粒细胞前体增殖相关蛋白测定分析 分别于PN7、PN14和PN21时，每组选取5只仔鼠，断头，剥离小脑。采用westernblot方法分别测定小脑Shh、N-Myc、CyclinD1、CyclinD2和E2F1的蛋白水平。全自动凝胶成像分析系统照相，测得各条带的净光密度值。 五、仔鼠小脑浦肯野细胞树突生长的形态学研究 分别于PN7、PN14和PN21时每组取5只仔鼠，4％多聚甲醛灌流固定小脑，石蜡包埋，切片。在PN7、PN14和PN21时，小脑浦肯野细胞层Calbindin和p-MAP2，Calbindin和p-Stathmin免疫荧光组织化学染色，观察仔鼠小脑浦肯野细胞树突形态学改变。用图像分析系统及图像分析软件分析小脑浦肯野细胞树突长度的变化。 六、仔鼠小脑浦肯野细胞树突生长相关蛋白测定分析 分别于PN7、PN14和PN21时，每组选取5只仔鼠，断头，剥离小脑。采用westernblot方法分别测定小脑MAP2、p-MAP2、Stathmin、p-Stathmin、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ的蛋白水平。全自动凝胶成像分析系统照相，测得各条带的净光密度值。 七、仔鼠小脑颗粒细胞平行纤维-浦肯野细胞(PF-PC)突触发育的形态学研究 分别于PN14和PN21时每组取5只仔鼠，4％多聚甲醛灌流固定小脑，石蜡包埋，切片。在PN14和PN21时，小脑VGluT1和Calbindin免疫荧光组织化学染色，观察仔鼠小脑颗粒细胞平行纤维-浦肯野细胞突触发育的形态学改变。用图像分析系统及图像分析软件分析小脑各蛋白表达的荧光平均强度。 八、仔鼠小脑颗粒细胞平行纤维-浦肯野细胞突触发育相关蛋白测定分析 分别于PN14和PN21时，每组选取5只仔鼠，断头，剥离小脑。采用westernblot方法分别测定小脑NRXN1、Cbln1、GluD2和PSD95的蛋白水平。全自动凝胶成像分析系统照相，测得各条带的净光密度值。 九、统计分析 结果表示为mean±SD。全部数据采用SPSS16.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析(ANOVA)比较各组间的统计学差异，当差异有统计学意义时，用SNK进行组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。 实验结果 一、孕期和哺乳期轻度碘缺乏引起仔鼠发生低甲状腺素血症 在仔鼠PN7、PN14和PN21时，轻度碘缺乏组、重度碘缺乏组和MMZ组的FT4水平显著低于对照组(P＜0.05)。轻度碘缺乏组的FT3水平略低于对照组，但差异无统计学意义;重度碘缺乏组和MMZ组的FT3水平显著低于对照组和轻度碘缺乏组(P＜0.05)。轻度碘缺乏组的TSH水平略高于对照组，但差异无统计学意义;重度碘缺乏组和MMZ组的TSH水平显著高于对照组和轻度碘缺乏组(P＜0.05)，差异均有统计学意义。 二、孕期和哺乳期轻度碘缺乏所致低甲状腺素血症减少仔鼠小脑颗粒细胞前体增殖 在PN7、PN14和PN21时，由Ki67和PCNA标记的增殖细胞在小脑外颗粒细胞层表达，呈强阳性，分布密集。与对照组相比，轻度碘缺乏组Ki67和PCNA阳性表达显著降低(P＜0.05)，有统计学意义;而重度碘缺乏组和MMZ组Ki67和PCNA阳性表达显著低于对照组和轻度碘缺乏组(P＜0.05)，差异均有统计学意义。 三、孕期和哺乳期轻度碘缺乏所致低甲状腺素血症降低仔鼠小脑颗粒细胞前体增殖相关蛋白表达 在PN7、PN14和PN21，轻度碘缺乏组、重度碘缺乏组和MMZ组仔鼠小脑Shh、N-Myc、CyclinD1、CyclinD2和E2F1蛋白表达较对照组显著降低(P＜0.05)，具有统计学意义;与轻度碘缺乏组相比，重度碘缺乏组和MMZ组仔鼠小脑Shh、N-Myc、CyclinD1、CyclinD2和E2F1蛋白表达显著降低(P＜0.05)，差异有统计学意义。 四、孕期和哺乳期轻度碘缺乏所致低甲状腺素血症损伤仔鼠小脑浦肯野细胞树突形态学 在PN7、PN14和PN21时，与对照组相比，轻度碘缺乏组、重度碘缺乏组和MMZ组仔鼠小脑浦肯野细胞树突总长度显著缩短(P＜0.05)，有统计学意义。而重度碘缺乏组和MMZ组仔鼠小脑浦肯野细胞树突总长度显著低于轻度碘缺乏组(P＜0.05)，差异有统计学意义。 五、孕期和哺乳期轻度碘缺乏所致低甲状腺素血症扰乱仔鼠小脑浦肯野细胞树突生长相关蛋白表达 PN7、PN14和PN21时，与对照组相比，轻度碘缺乏组、重度碘缺乏组和MMZ组仔鼠小脑p-MAP2、p-Stathmin、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表达显著降低(P＜0.05)，Stathmin蛋白表达显著升高(P＜0.05)，差异具有统计学意义，MAP2蛋白表达较对照组降低，但不具统计学意义;重度碘缺乏组和MMZ组仔鼠小脑p-MAP2、p-Stathmin、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白与轻度碘缺乏组相比，表达显著降低(P＜0.05)，而Stathmin蛋白表达显著升高(P＜0.05)，具有统计学意义，MAP2蛋白表达只有在PN14降低有统计学意义。 六、孕期和哺乳期轻度碘缺乏所致低甲状腺素血症损伤仔鼠小脑PF-PC突触发育 在PN14和PN21时，镜下可见，由VGluT1和Calbindin标记的PF-PC突触在小脑分子层表达，呈阳性，分布较密集。与对照组相比，轻度碘缺乏组VGluT1和Calbindin阳性表达显著降低(P＜0.05)，有统计学意义;而重度碘缺乏组和MMZ组VGluT1和Calbindin阳性表达显著低于对照组和轻度碘缺乏组(P＜0.05)，差异均有统计学意义。 七、孕期和哺乳期轻度碘缺乏所致低甲状腺素血症下调仔鼠小脑PF-PC突触发育相关蛋白表达 在PN14和PN21，轻度碘缺乏组、重度碘缺乏组和MMZ组仔鼠小脑NRXN1、Cbln1、GluD2和PSD95蛋白表达较对照组显著降低(P＜0.05)，具有统计学意义;与轻度碘缺乏组相比，重度碘缺乏组和MMZ组仔鼠小脑NRXN1、Cbln1、GluD2和PSD95蛋白表达显著降低(P＜0.05)，具有统计学意义。 结论 1、孕期和哺乳期轻度碘缺乏所致低甲状腺素血症通过抑制Shh信号传导途径而减少小脑颗粒细胞前体增殖。 2、孕期和哺乳期轻度碘缺乏所致低甲状腺素血症限制小脑浦肯野细胞树突总长度，其可能机制是扰乱小脑MAP2、p-MAP2、Stathmin、p-Stathmin、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表达水平。 3、孕期和哺乳期轻度碘缺乏所致低甲状腺素血症通过抑制NRXNs-Cbln1-GluD2三联体信号传导途径而损害小脑PF-PC突触发育。