目的:　　血管生成是指在现有的血管基础上形成新的毛细血管并不断重塑的过程。正常的脑血管结构对中枢神经系统的发育以及功能的维持具有重要意义。研究表明，在多种神经系统疾病中均存在脑血管生成异常，而脑血管结构和功能的异常对这些疾病的发生、发展和治疗均产生重要影响。因此，探讨调节脑血管生成的机制就显得尤为重要。自噬是真核细胞内一个依赖于溶酶体的重要的降解途径，参与调解内皮细胞包括血管生成在内的的多种功能。本文则通过体内外抑制脑血管内皮细胞中自噬相关基因Atg7的表达来探讨自噬在脑血管生成中的作用和调节机制。　　中风是世界范围内成人第二大致死和致残性疾病，可由多种原因引起，其中以缺血性中风为最主要的中风形式。缺血性中风的病理过程非常复杂，氧气和葡萄糖的缺乏导致一系列通路的激活。有证据表明，炎症和免疫系统参与了急性脑缺血的全部过程，抑制脑内炎症水平会减少中风导致的脑梗死体积和神经损害，从而有效减少缺血/再灌注带来的脑损伤。自噬在调节免疫反应中的地位极为重要，但是关于中风后自噬是否具有神经元保护作用，大部分的研究都是不确定的或者矛盾的。为了从一个新的角度去理解自噬在脑缺血/再灌注损伤中发挥的作用，我们采用内皮细胞条件性敲除Atg7的小鼠进行实验，体内外模拟中风条件，来探讨内皮细胞自噬对脑缺血/再灌注损伤的影响和调节机制。　　方法:　　1、选取3个月月龄的血管内皮细胞条件性敲除Atg7的雄性纯和鼠（Atg7-/-）和同窝Cre阳性的雄性野生鼠(wild type，WT)，经心脏灌流取脑，做震荡切片，免疫荧光染色比较WT鼠与Atg7-/-鼠脑血管生成情况。　　2、利用matrigel实验，比较HBMEC对照株(negative control，NC)与Atg7干扰株（Sh-Atg7）在不同时间点的血管生成情况。　　3、待NC与Sh-Atg7细胞株长到90％密度时，分别用trizol裂解，送mRNA芯片。分析比较二者芯片结果，寻找与血管生成相关且表达发生显著改变的因子。　　4、Real-time PCR检测比较NC和Sh-Atg7中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的表达情况，以确认芯片结果。　　5、ELISA实验检测比较NC和Sh-Atg7分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和VEGF的蛋白量。　　6、选取3个月月龄的WT鼠和Atg7-/-鼠，分别提取鼠脑总mRNA，Real-time PCR检测比较二者IL-6和VEGF的表达情况。　　7、利用matrigel实验，在不同时间点检测炎症介质IL-6能否补救Sh-Atg7细胞株的血管生成障碍。　　8、Western blot实验检测干扰Atg7后，在生理及应激条件下，HBMEC中NF-κB通路p-IKK、p-IKBα及IKBα的表达情况。　　9、利用核浆分离实验、免疫荧光染色技术和凝胶迁移阻滞实验(EMSA)，检测p65及HIF-1α的表达、入核及与DNA结合情况。　　10、构建并筛选高表达Atg7的HBMEC细胞株，Real-time PCR检测Atg7高表达是否影响内皮细胞炎症介质转录水平。　　11、Western blot检测p62降解情况，来确认干扰Atg7是否影响内皮细胞的自噬水平。并用自噬的特异性抑制剂3-MA处理正常内皮，Real-time PCR检测相应的炎症介质转录表达情况。　　12、做缺血0.5h的小鼠，再灌注24h后，评估小鼠神经症状，用脑切片模具，切成2mm厚，每个鼠脑5片，然后用2％的TTC染色20min，再换成10％的多聚甲醛浸泡2h，拍照，统计分析鼠脑梗死大小。　　13、做缺血0.5h再灌注24h小鼠，将鼠前脑的缺血侧第4-8mm trizol裂解，提取mRNA，反转录成cDNA，Real-time PCR检测比较Atg7-/-鼠与WT鼠缺血侧脑的炎症介质转录表达情况。　　14、OGD模型:体外以正常的HBMEC为研究对象，先氧糖剥夺5h，再进行正常培养，以模拟缺血/再灌注损伤。分别将再灌注3h、6h、12h和24h的HBMEC用trizol裂解，提取mRNA，反转录成cDNA，Real-time PCR检测不同再灌注时间点的炎症介质转录表达情况。其中，0h为没进行缺血处理的对照组。　　结果:　　1、Atg7-/-鼠脑皮质微血管生成减少。　　2、与对照株相比，Atg7干扰株血管生成能力受到抑制。　　3、与对照株相比，Atg7干扰株中与血管生成相关的炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的转录水平显著低下。　　4、Real-time PCR进一步证实芯片结果。　　5、干扰Atg7后，HBMEC分泌的IL-6显著减少。　　6、血管内皮细胞条件性敲除Atg7后，鼠脑炎症水平降低。　　7、IL-6能够恢复Sh-Atg7细胞株的血管生成能力。　　8、干扰Atg7后，HBMEC中NF-κB通路的IKK活化增强，但IKBα表达量增加;在应激条件下，NF-κB通路活化良好，但IKBα表达仍然较对照株多。　　9、干扰Atg7后，p65及HIF-1α入核减少，且p65与NF-κB探针结合减少，而HIF-1α分布弥散。　　10、Atg7高表达不影响内皮细胞炎症介质转录水平。　　11、干扰Atg7后，内皮细胞自噬水平降低。抑制自噬能够抑制内皮细胞炎症介质转录。　　12、敲除Atg7减少鼠脑缺血/再灌注损伤。　　13、敲除Atg7减少鼠脑缺血/再灌注24h的炎症水平。　　14、不能用OGD模型模拟HBMEC缺血/再灌注后的炎症变化。　　结论:　　1、脑微血管内皮细胞抑制Atg7表达后，p65及HIF-1α出现功能障碍，进而抑制了细胞内炎症介质IL-6的转录和分泌，并最终抑制脑微血管生成。　　2、血管内皮细胞条件性敲除Atg7的小鼠，在脑缺血/再灌注后，鼠脑炎症水平显著降低，从而减轻了脑缺血造成的损伤。