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目的:探讨山核桃叶总黄酮苷元及5种单体成分对体外血管生成的抑制作用及其初步的机制;根据筛选出的药效较强的单体成分,建立体外细胞模型,以miRNA-21(miR-21)为靶点,探讨miR-21在该化合物抑制血管生成中的作用,为血管性疾病提供一个新的治疗靶点。方法:(1)体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),建立细胞生长曲线,采用细胞计数法分析血管内皮生长因子(VEGF)诱导的HUVECs增殖能力。(2)利用大鼠动脉环血管新生实验,观察山核桃叶黄酮苷元对VEGF诱导血管新生的抑制作用。(3)采用细胞计数法、伤口愈合实验等方法检测山核桃叶黄酮苷元对VEGF诱导的HUVECs增殖和迁移能力的影响,并采用Western blotting技术检测HUVECs中ERK1/2和AKT磷酸化蛋白的表达。(4)采用SYBR荧光定量PCR检测不同时间段的一定浓度小豆蔻明(cardamonin,Car)对 VEGF 诱导的 HUVECs 中 miR-16,miR-21,miR-23a 等 miRNAs的表达情况,从而筛选出变化较明显的miRNA进行后续研究。(5)用miR-21抑制剂和模拟物分别转染HUVECs,SYBR荧光定量PCR法检测miR-21的表达。转染后,采用MTS和伤口愈合实验检测Car对VEGF诱导的HUVECs增殖和迁移能力,体外血管生成实验检测Car对小管生成的影响。结果:(1)根据HUVEC生长曲线,采用细胞密度2×104/mL、培养24h换液后的HUVECs进行后续实验。8 ng/mLVEGF作用下HUVECs增殖显著性增加(p<0.01),而4ng/mL和 10 ng/mL VEGF 作用下 HUVECs 增殖无明显变化(p>0.05)。8 ng/mL VEGF 处理 12 h和24 h时,HUVECs增殖呈浓度依赖性增加(p<0.01),其中24 h时增殖达到最大。(2)动脉环培养14 d后,与VEGF组比较,总黄酮苷元(TF)和5种单体明显抑制小管生成(p<0.01),其中Car的抑制效果最好,而球松素查尔酮的抑制效果最差。(3)TF,Car,白杨素(chrysin)和松属素(pinocembin)明显的抑制VEGF诱导的HUVECs增殖和迁移,球松素查尔酮(PC)和汉黄芩素(wogonin)抑制作用不明显。其中,Car的抑制作用最强。且Car浓度依赖性地降低p-ERK1/2/ERK1/2和p-AKT/AKT表达。(4)SYBR荧光定量PCR结果表明,Car作用不同时间后,miR-16,miR-21,miR-23a等miRNAs中表达量变化相对较明显的是miR-21。(5)miR-21抑制剂和模拟物分别转染HUVECs 24 h后,miR-21的表达明显的降低和升高。转染后,与Car组相比,miR-21抑制剂组明显抑制50μM Car孵育的HUVECs增殖、迁移,以及管样结构的生成,而miR-21模拟物组明显促进50 μM Car孵育的HUVECs增殖、迁移,以及管样结构的生成。结论:(1)山核桃叶TF及5种单体能抑制大鼠动脉环血管新生,其中药效最强的单体是Car。(2)Car能抑制动脉环血管生成,其机制可能是通过抑制HUVECs增殖和迁移,干预p-ERK1/2/ERK1/2和p-AKT/AKT的表达。(3)Car作用不同时间后,miR-16,miR-21,miR-23a等miRNAs中表达量变化相对较明显的是miR-21,miR-21可能介导了 Car抑制VEGF诱导的血管新生作用。