心血管疾病已成为影响人类健康的头号杀手,据统计,每年全球近数千万人死于急性心血管事件(ACS和／或心脏性猝死)。而且大部分人没有前驱症状,现有的诊断技术难以在心血管事件前发现受害者。易损斑块的破裂、血小板聚集、血栓形成造成冠脉闭塞是ACS的发病机制已成为共识。其中动脉粥样易损斑块的破裂又视为ACS发生中最重要的始动环节。纤维帽中的细胞外基质的大量降解是斑块破裂的主要分子机制。如何在急性心血管事件发生前及早和准确地识别出易损患者并进行积极有效的干预已成为迫切的问题。炎性标志物被越来越多地应用于ACS的病情监测,对预测易损斑块的破裂具有很高的临床价值。血清学标志物相对于其它检测手段,除了反应高危斑块外,还能够体现冠状动脉疾病的总的负荷,另外具有非侵入性,能够普遍推广,以及具有好的预测价值的特点。因此,寻找一个敏感性和特异性高的生物学标志物是我们的研究方向。MMP-2和MMP-9是目前发现的重要的ACS的炎性标记物。MMPs产生于动脉粥样硬化斑块的脂质核心,与巨噬泡沫细胞共同存在,并能在外周血中检测到。MMPs通过降解纤维帽中的胶原和基质,使纤维帽逐渐变薄,易于破裂。ADAMTSs是最近发现的一个新的金属蛋白酶家族成员,其分子结构及蛋白水解作用类似于MMPs。两者都含有锌依赖的内肽酶,参与ECM的蛋白水解作用。不同于MMPs, ADAMTSs还有去整合素结构域和血小板反应素结构域。RT-PCR显示ADAMTS-4 mRNA在单核细胞里被诱导表达。在单核细胞分化为巨噬细胞过程中,ADAMTS-4 mRNA的表达升高20-30倍。另外,ADAMTS-4 mRNA表达也随着小鼠的动脉粥样硬化的进展而上调。最新的研究发现ADAMTS-4在人的动脉粥样硬化颈动脉斑块和冠状动脉不稳定斑块的富含巨噬细胞的部位里高表达。然而,其在非动脉粥样硬化动脉里表达非常低。粥样斑块中存在丰富的巨噬细胞。斑块的纤维帽中侵入的巨噬细胞越多,斑块就越脆弱,这与巨噬细胞分泌蛋白水解酶降解ECM导致纤维帽变薄有关。由此我们推断,不稳定斑块的巨噬细胞丰富的区域里有ADAMTS4高表达,其作用也有可能类似于MMPs,通过降解ECM导致纤维帽变薄,进而诱导斑块的破裂。ECM维持斑块结构完整性。纤维帽越薄,周向应力峰值越高,斑块越易于破裂。ECM的成分包括胶原,蛋白多聚糖(versican, biglycan, and decorin),弹性蛋白,层粘连蛋白,纤维结合素,巢蛋白。Versican是一个高分子量硫酸软骨素蛋白多聚糖,是正常血管的成分之一,在脂质核心和纤维区域连接处维持斑块的结构完整性。Versican有4个异构体(V0,V1,V2,和V3),V0,V1和V2拼接变异反映在粘多糖(GAG) (GAG-α和GAG-β)结构域的数目差异。V3缺乏(GAG-α和GAG)。它们共同分享其余的结构域包括氨基酸末端球结构域(G1)和羧基末端G3结构域以及硫酸软骨素(CS)侧链。血管壁里的versican主要是V0和V1,主要位于动脉的内膜和内膜下中层。在质脂条纹期和纤维斑块期,Versican和胶原含量较多。在高危斑块薄的纤维帽里,versican成分明显减少。因此,versican的结构瓦解可能导致纤维帽的不稳定和破裂。另外versican也在血栓形成,脂质代谢,和血管平滑肌细胞增殖和迁移中发挥着重要的作用。ADAMTS4能够降解ECM成分aggrecan和versican,关节炎患者的关节腔滑液里存在着aggrecan的降解片段,表明ADAMTS4通过降解aggrecan导致关节软骨毁坏引发类风湿和骨关节炎。以此类推,ADAMTS4也可能通过酶切血管壁里的versican和／或aggrecan引起动脉粥样硬化。ADAMTS-4在Glu441-Ala442／Glu1428-Ala1429位点酶切V1/V0 versican,免疫组化分析显示人的动脉粥样硬化斑块和腹部动脉瘤里有酶切产物,且在正常人的动脉抽提物中也发现了其蛋白水解产物。最近研究表明versican的酶切片段与血管的生理和病理都存在密切的关系。G3片段能提高内皮细胞的迁移性,促进内皮细胞分泌血管内皮生长因子,对SMCs产生趋化性。另外,G3片段通过结合P选择素糖蛋白配体-1,诱导白细胞募集到炎症部位,白细胞聚集又能加剧血栓的形成。凭借多聚阴离子的特性,versican的硫酸软骨素链(CS)与血小板上的CD44,L-选择素,P-选择素配体结合。促进血栓的形成。除了ECM的蛋白水解,细胞黏附也是动脉粥样硬化的中心环节。去整合素结构域能够与整合素分子相互作用,调节细胞-细胞,细胞-基质黏附作用。进而促进动脉粥样硬化。TSP-Ⅰ结构域能与基质大分子结合。ADAMTS4的TSP-1结构域对于底物的识别和酶切是至关重要的。基于上述事实,ADAMTS4在高危斑块里高表达；Versican是ADAMTS4的作用底物。我们提出假设ADAMTS4通过降解细胞外基质versican导致斑块破裂。另外,versican的降解片段也参与血管的病理改变；金属蛋白结构域,去整合素结构域和血细胞板反应素结构域共同存在,不同的结构域具有独立和互补作用。我们推测在动脉粥样硬化的进展中ADAMTS4比MMPs作用更强大,有希望成为反映动脉粥样硬化斑块不稳定的新的炎性标志物。类似于MMPs,ADAMTSs能被组织金属蛋白酶抑制因子(TIMPs)抑制。ADAMTS4的羧基末端结构域参与结合TIMPs,TIMP-3是ADAMTS4强大的抑制剂。因此我们提出ADAMTS4／TIMP3的比值失调,导致versican的合成和降解失调也是斑块不稳定的原因。血管平滑肌细胞(VSMC)向内膜增殖和迁移是动脉粥样硬化斑块形成、高血压、血管再狭窄等疾病的共同发病基础之一,在动脉粥样硬化早期,来自中层的VSMCs能够迁移到内膜,内膜增厚管腔呈现出收缩性狭窄,血流限制,表现为稳定性心绞痛。尽管其始的触发这些时间的原因不清楚,但比较认可的原因是：VSMCs释放的蛋白酶降解内膜里的基质蛋白,尤其蛋白多聚糖的主要成分versican,导致内膜容易被VSMCs入侵。已经有报导ADAMTSs家族的ADAMTS1与VSMCs迁移增殖,血管重塑有关。ADAMTS4是否也具有上述作用是未知数。本研究旨在探讨ADAMT4能否作为临床上检测易损斑块的炎性标志物,并为其导致斑块不稳定的机制提供依据。我们推测ADAMTS-4通过两条途径促进动脉粥样硬化作用：在病变的进展中通过调节动脉平滑肌细胞迁移和发挥作用,也通过影响纤维帽的强度影响斑块的稳定。本学位论文的主要研究内容及实验结果如下：一、稳定心绞痛和急性冠状动脉综合征患者外周血ADAMTS4抗原水平的变化自2008年6月-2009年5月入选了132个患者和40个健康对照者。其中包括25个SAP,32个UAP,35个NSTEMI和40个STEMI,在发病3h-9h内到达我们中心。有感染、肿瘤、肝病或肾病的患者均排除。患者及对照组在入院即刻,以及冠脉造影和药物应用之前从肘静脉抽血。接受药物治疗的ACS患者在入院后的第1,2,3,5和7天连续采集血样。ADAMTS4和hs-CRP用EIASA试剂盒检测,TnT采用第三代电化学发光免疫测定法检测。病例组的血浆ADAMTS4水平(99.2(65.8；149.2)ng／mL)明显高于对照组(51.2(38.1:64.8)ng／mL)(P<0.001).SAP组(63.1(45.2-90.3)ng／mL)；UAP组(87.5(59.4-135.6)ng／mL)；NSTEMI(113.6(68.5-160.2)ng／mL)；STEMI (127.3(76.8-220.2)ng／mL),随着病情的进展,ADAMTS4抗原水平进行性升高(P<0.001).ADAMTS4的ROC曲线下面积是0.753(95％CI 0.654-0.851:P=0.000),hs-CRP的ROC曲线下面积是0.665(95％CI 0.559-0.772;P=0.010);两者之间存在显著差异(P<0.001)。在不同类型的ACS中ADAMTS4释放曲线有明显的差异。在UAP药物治疗组,ADAMTS4在入院第2天明显提高。NSTEMI药物治疗组和STEMI药物治疗组在入院第3天达到高峰。ACS患者hs-CRP和ADAMTS4之间存在相关性(r0.719,P=0.02:r=0.660,p=0.01:r=0.888,p=0.000)；ADAMTS4最高值与hsCRP最高值之间也存在相关(r=0.700,P=0.03:r=0.632,p=0.02:r=0.769,p=0.03)。然而,在SAP患者中,没有明显的相关性(r=0.316,p=0.124)。在ACS患者中,ADAMTS4和TnT没有明显的相关性。外周血浆ADAMTS4抗原水平可以作为斑块不稳定的标志物。二、ADAMTS4在ACS患者外周血单个核细胞中的mRNA表达及其与复杂冠状动脉粥样硬化病变相关性的研究2008年1月-2009年2月入选了150受试者。包括50个UAP患者,30个AMI患者,40个SAP患者,30个正常对照。所有患者都接受冠状动脉造影。采用TRIzol从单个核细胞里抽提总RNA。用RT-PCR方法分析单核细胞的ADAMTS4mRNA表达。狭窄的冠状动脉病变形态学分析参照Ambrose分类法,分为简单和复杂病变。冠状动脉狭窄的严重程度用Gensini Score (GS)方法评估。病例组ADAMTS4 mRNA水平明显高于对照组(2.014±1.15 vs 1.201±0.402)(P<O.001)。与SAP组比较,ACS组的ADAMTS4 mRNA表达更高(2.236±0.108 vs 1.333±0.432) (P<0.001)。ADAMTS4 mRNA表达水平与复杂的冠状动脉复杂病变之间存在明显的正相关(r=0.58, p<0.001)。然而,病例组ADAMTS4 mRNA水平和Gensini评分之间无明显相关性(r=0.118, P=0.201)。ACS组与SAP组比较,复杂病变常见于ACS组(92%vs.13%,p<0.01).ACS患者外周血单个核细胞里ADAMTS4 mRNA表达提高,与复杂的冠状动脉病变存在正向关,与狭窄的严重程度无明显相关性,因此ADAMTS4是不稳定斑块的有效的标志物。三、动脉粥样硬化进展过程中ADAMTS4, TIMP3, versican基因表达的动态改变选择9周龄的遗传背景C57BL／6的雄性apoE-／-小鼠,给予正常饮食喂养50周。小鼠分别在10周(n=8)、20周(n=6)、30周(n=7)、40周(n：5)、50周(n=5)麻醉处死。分离出主动脉,用Trizol提取RNA。采用Real-time RT-PCR方法测定ADAMTS4, TIMP3, versican的mRNA量,用betactin平衡。结果显示versican在动脉粥样硬化早期已经出现。在20周达到峰值,然后表达逐渐降低,在50周时降到正常水平。在各个时期,小鼠主动脉中均没有aggrecan mRNA表达。ADAMTS-4 mRNA在10周龄已经存在于小鼠的动脉里。随着疾病的进展表达逐渐提高。在20周-30周ADAMTS-4 mRNA继续增高,40周-50周与10周比较ADAMTS-4 mRNA表达量提高了近3倍。TIMP3和ADAMTS4具有相似的表达模式。尽管TIMP3随着时间表达逐渐提高(P<0.001),但是ADAMTS4/TIMP3比值随着时间提高更显著。在30周前,ADAMTS4和versican之间无相关性(r=0.308, p=0.415;r=0.412, p=0.352; r=0.589, p=0.172);在40和50周,在ADAMTS4和versican之间存在显著的相关性(r=0.688, p=0.02; r=0.712, p=0.000)。30周前,TIMP-3水平与versican不存在相关性(r=0.411, p=0.395; r=0.282, p=0.572; r=0.379, p=0.220); 40和50周,TIMP3和versican之间存在明显的相关性(r=0.603, p=0.03; r=0.694, p=0.002)。ADAMTS4在动脉粥样硬化进展过程中表达上调,TIMP3与ADAMTS4增长不成比例,表明ECM的versican合成和降解的失平衡。在动脉粥样硬化早期,versican表达提高表明versican可能与脂质蛋白的储留有关,在后期下降归因于被ADAMTS4的蛋白水解。四、在有破裂倾向的动脉粥样病变里,ADAMTS4与versican共表达。选择遗传背景C57BL／6的10周龄的雄性apoE-/-小鼠。在手术前2周给予高脂高胆固醇饮食。用巴比妥(40-50mg／kg)腹腔注射麻醉小鼠。在其颈总动脉分叉以下用聚乙烯套环固定(2mm长度,内外径分别为：0.58mm/0.965mm),继续给予高脂高胆固醇饮食喂养20周。颈圈放置20周,动物被处死前24小时,给予苯肾上腺素腹腔注射(8μg／kg),电击小鼠的足底,冰浴20分钟。麻醉后,右心耳摘除,左心室灌注PBS,将血管里血液冲洗干净。颈总动脉及其分支都被移除。将血管浸埋于OCT包埋剂,然而将组织投入液氮中10～20秒；使用恒温冷冻切片机,连续切片,切片厚度为5um,按照顺序编号,切好的冰冻切片,室温下自然晾干1～2h后,放入4℃丙酮固定10分钟,待干燥后封存于-20℃。相邻的片子,一张用于检测ADAMTS4蛋白表达；另一张用于versican的蛋白表达；剩余一张用于Movt’s Pentachrome特殊染色。对于阴性对照组,我们以等比稀释度用preimmune血清处理切片。抗-ADAMTS4抗体被稀释1：200,抗-versican抗体被稀释1：250。参照Vectastain ABC Elite试剂盒厂家说明。3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐作为发光底物。切片用Harris hematoxylin复染。我们用Pentachrome着色切片识别弹性蛋白,胶原,蛋白多聚糖沉淀区域。绿-浅绿着色提示蛋白多聚糖,该部位有ADAMTS4阳性表达。Veriscan的免疫着色证实,也存在于相同的部位。在倾向于斑块破裂的部位,ADAMTS4表达和versican空间结构相关性提示versican被ADAMTS4降解导致斑块的不稳定。五、ADAMTS4促进血管平滑肌细胞的迁移。用Transwell’s小室法检测VSMCs的迁移。RT-PCR被用来观察ADAMTS4 mRNA表达。RT-PCR显示迁移VSMCs的ADAMTS4 mRNA (13.1±6.5)明显高于静止期VCMCs(4.3±1.5)(p<0.01)。ADAMTS4在体外能有效的促进VCMCs迁移。我们的研究显示ADAMTS-4可能通过调节VSMC迁移引起动脉粥样硬化。