目的：　　为了更好地推动间充质干细胞在再生医学中的应用，必须在较短的传代次数内保持较高的增殖活性，才能保证得到治疗所需庞大的细胞数量。这就要求对间充质干细胞体外培养时增殖活性调控的机制有一个详细的研究与理解。　　MicroRNA即miRNA是体内生成的约20-22个碱基长度的小、单链非编码RNA，通过非完全性碱基互补靶向mRNA，从而在转录后水平发挥了重要的调控作用，如调控MSC的分化、旁分泌活性、增殖、生存及迁移等，最近的发现表明通过修饰MSC中miRNA的这种方式有助于促进MSC临床应用潜能。　　本课题旨在探索miRNA对人脐带来源间充质干细胞（hUC-MSC）体外增殖的调控作用，为其临床应用提实验支持。通过查找已有的MSC相关的miRNA数据库进行筛查及实验验证寻找能够影响hUC-MSC体外增殖的miRNA分子，发现miR26b-3p能够抑制MSC的增殖并随hUC-MSC体外传代而逐渐升高，通过生物信息学及实验验证，最终发现miR26b-3p可以靶向雌激素受体α（ESR1）并负向调控其mRNA及蛋白水平,继而下调ESR1的下游效应分子CCND1的表达来抑制hUC-MSC体外增殖速率。　　第一部分：筛选能够影响hUC-MSC的miRNA分子　　方法：(1)在NCBI网站上中输入关键词“microRNA”及“mesenchymal stem cell”查询并下载查阅相关文献，寻找已发表的相关数据中表明能够影响细胞增殖的miRNA。(2)Real-time PCR(qRT-PCR)检测在hUC-MSC体外培养时早晚代有升高趋势的miRNA。(3)设计并合成miR26b-3p的模拟体(mimics)及抑制剂(inhibitor)的序列，在hUC-MSC中进行转染并利用qRT-PCR验证其转染效率，同时优化转染条件。(4)利用EdU掺入实验、细胞周期分析及生长曲线测定来检测miRNA对hUC-MSC增殖的影响。　　结果：(1)通过文献查找，找到MSC分泌的miRNA数据库，筛选影响细胞增殖的miRNA分子，我们找到了miR26b-3p。(2)qRT-PCR结果显示miR26b-3p在hUC-MSC体外培养各代中的内源性表达量呈现一种升高的趋势。(3)实验结果表明所用miR26b-3p的mimics及inhibitor能分别上调及下调miR26b-3p的表达。(4)EdU掺入实验结果表明在过表达miR26b-3p mimics后hUC-MSC EdU荧光掺入量较对照组低，而过表达miR26b-3pinhibitor则高于对照组，表明miR26b-3p能抑制hUC-MSC的增殖；流式细胞周期结果也表明miR26b-3p可以延长细胞周期的G1期；生长曲线结果可见，过表达miR26b-3p后细胞生长减慢而抑制后生长增加。　　结论：通过已发表数据库、功能筛查及实验验证，最终找到miR26b-3p，在间充质干细胞体外培养传代过程中呈上升趋势，并通过多种实验确定其对hUC-MSC增殖抑制的作用。　　第二部分：miRNA靶基因的筛选及功能验证　　方法：(1)利用miRNA靶基因预测软件TargetMiner的高通量及全面的预测能力筛查能够与miR26b-3p碱基互补结合的mRNA，并通过查阅文献挑选能影响细胞增殖的mRNA作为候选靶mRNA。(2)外源性过表达miR26b-3p后，qRT-PCR来检测候选靶基因RNA表达量，最终确定与miR26b-3p变化趋势相反的靶基因。(3)蛋白印迹实验检测靶基因蛋白变化情况，确定miR26b-3p是否改变靶基因的蛋白表达量。(4)将包含miR26b-3p结合位点的ESR1CDS序列及结合位点突变序列构入report载体，双荧光素酶报告基因实验验证miR26b-3p与ESR1的直接靶向结合。(5)通过补救实验，荧光显微镜下直接观察ESR1及miR26b-3p对hUC-MSC增殖的影响。(6)qRT-PCR检测ESR1在hUC-MSC体外传代培养过程中的变化趋势。(7)寻找ESR1的下游通路并挑选已被报道参与调控细胞增殖的重要信号分子.(8)qRT-PCR检测过表达miR26b-3p mimics及inhibitor后下游效应分子的mRNA的表达量改变，筛查表达量有差异的信号分子。(9)补救实验中qRT-PCR锁定ESR1的下游效应分子。　　结果：(1)通过软件预测及查阅相关文献确定7条mRNA作为miR26b-3p的候选靶基因。(2)qRT-PCR结果显示ESR1mRNA变化同miR26b-3p相反且变化明显。(3)蛋白印迹显示miR26b-3p可以负向调控ESR1的蛋白变化。(4)双荧光素酶报告基因实验证明miR26b-3p与ESR1的靶向结合关系。(5)荧光显微镜下可见，干扰miR26b-3p后能部分抵消因加入雌激素受体抑制剂氟维司群引起的细胞增殖抑制效应，而过表达miR26b-3p后也能部分抵消因加入雌激素受体激动剂17-β雌二醇引起的细胞增殖增加效应。(6)qRT-PCR及蛋白印迹表明，ESR1在RNA及蛋白水平上都随hUC-MSC体外传代次数的增加而减少，呈现一种下降趋势。(7)找出11条ESR1下游效应分子。(8)qRT-PCR发现在11条下游效应分子中，只有CCND1基因的表达量改变符合预期设想。(9)补救实验锁定CCND1作为ESR1下游效应分子。　　结论：通过miRNA网络预测软件TargetMiner及NCBI功能查阅，初步筛选7条miR26b-3p的候选靶基因，检测相应mRNA及蛋白水平的变化，最终确定其靶基因为ESR1，并得到双荧光素酶报告基因实验的验证。补救实验表明miR26b-3p可以通过靶向调控ESR1来抑制hUC-MSC的增殖，并且ESR1的RNA及蛋白表达量都随传代呈现下降趋势。本课题还发现CCND1是miR26b-3p靶向调控ESR1后发挥功能的重要下游分子。综上所述，miR26b-3p可以靶向调控ESR1的mRNA及蛋白的表达量，并下调ESR1下游效应分子CCND1，实现对hUC-MSC的增殖抑制调控。　　第三部分：miR26b-3p对hUC-MSC其他生物学效应的影响　　方法：(1)qRT-PCR检测miR26b-3p对hUC-MSC的自发性分化的影响。(2)qRT-PCR检测miR26b-3p对hUC-MSC的向脂、骨及软骨分化的影响。(3)qRT-PCR检测miR26b-3p对hUC-MSC的衰老相关基因表达量的影响。　　结果：(1)miR26b-3p促进hUC-MSC自发性分化特异性基因的表达量。(2)miR26b-3p促进hUC-MSC脂特异性基因PPARγ的表达。(3)miR26b-3p促进hUC-MSC衰老相关基因的表达。　　结论：qRT-PCR发现miR26b-3p可以促进hUC-MSC自发性分化基因、脂特异性基因及衰老相关基因的表达，提示其促分化、衰老作用。　　小结　　本课题通过查找MSC相关miRNA数据库，结合功能筛选出可以调控细胞增殖的miRNA分子，最终发现miR26b-3p对hUC-MSC抑制增殖作用，并随hUC-MSC体外传代而呈现上升趋势。通过TargetMiner软件系统性地预测miR26b-3p的靶基因，结合功能筛查及实验验证，发现miR26b-3p可以靶向ESR1负向调控其RNA及蛋白的表达。ESR1的RNA及蛋白表达量随细胞传代呈下降趋势，这刚好与miR26b-3p相反。ESR1是一种受雌激素调控的转录因子，介导雌激素对组织的生长调控效应，在实验中我们发现ESR1激动剂17-β雌二醇可以促进细胞增殖，而其抑制剂氟维司群能明显抑制细胞增殖。干扰miR26b-3p后能部分抵消因加入雌激素受体抑制剂氟维司群引起的细胞增殖抑制效应，而过表达miR26b-3p后也能部分抵消因加入雌激素受体激动剂17-β雌二醇引起的细胞增殖增加效应，从功能上证实了两者的关系。在进一步探索miR26b-3p对hUC-MSC细胞增殖调控机制的过程中，发现CCND1即细胞周期蛋白D1作为ESR1的下游效应分子在细胞增殖调控中发挥了重要的作用。qRT-PCR发现miR26b-3p促进hUC-MSC自发性分化及成脂分化能力，还能促进细胞的衰老。　　本研究首次提出并证实miR26b-3p能抑制hUC-MSC的增殖，且其作用机制是降低ESR1的表达继而下调CCND1来抑制细胞的增殖，并发现该miR26b-3p的表达随传代次数增加而增加,为深入理解hUC-MSC体外增殖调控机制做出一定的贡献。