伪狂犬病（Pseudorabies,PR,又名Aujeszky’s disease,AD）,是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病,该病是危害养猪业的主要传染病之一,每年造成巨大的经济损失。伪狂犬病病毒（PRV）属于疱疹病毒科中的α疱疹病毒亚科,在PRV的潜伏感染期,动物体内检测不到病毒粒子,也不向外排毒,但在相应应激因素的刺激下,潜伏感染的PRV可被激活,可重新产生感染性病毒粒子,导致动物发病,并向外排毒。关于PRV潜伏感染的建立、维持及激活机制尚不明确,控制和根除伪狂犬病所面临的主要障碍是PRV的潜伏感染问题。现有报道显示,猪体外接种PRV可导致神经节细胞的激活,猪神经节细胞的活化主要表现为形态的变化、炎症因子的分泌以及细胞的增殖,而NF-кB信号通路是病原感染引起神经节细胞分泌炎症因子的关键信号通路,病毒激活NF-κB信号通路,NF-κB信号通路的活化会启动很多炎症因子的表达,继而激活宿主的免疫系统;细胞因子方面,病毒感染免疫细胞后造成细胞死亡,导致很多细胞因子的释放,如IL-1、IL-6和IL-8以及TNF-α、INF-α和INF-β。PRV通过何种信号通路激活TG细胞,其分子机制仍不清楚。为了进一步帮助更好地解决上述问题,本研究开展了PRV激活小鼠三叉神经节细胞（TG）NF-кB信号通路的探究,其相关研究内容如下:1、PRV感染小鼠三叉神经节细胞的研究本研究采用胰蛋白酶、DNA酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶的组合消化成年小鼠三叉神经节制备TG细胞,培养1～3 d贴壁,5～6 d生长成熟,TG细胞尼氏染色为蓝色,第7～8 d开始衰老死亡,11～12 d全部死亡。通过分离培养观察鉴定,小鼠TG细胞的正常形态是个体较大,边缘有许多的类似神经元细胞突触的结构,但突触的形状、大小各有不同,细胞边缘成不规则的齿轮状,细胞核一般在细胞的中心位置,TG细胞衰老的过程是呈现出细胞先出现周边逐渐变亮、变小,核的颜色变深,最后是突触断裂、消失和细胞变圆变亮而死亡。研究结果表明:采用该培养方式能够成功分离培养出小鼠TG细胞,而且生长良好,形态稳定,但不能消化传代和冻存,只能原代培养。用PRV感染TG细胞,观察发现TG细胞被PRV感染后期均能出现相应的细胞病变效应（CPE）,研究发现:在接毒PRV 48 h后开始出现CPE,72 h内细胞开始死亡,与对照组的正常TG细胞相比较,接毒组死亡时间提前2～3 d,而对照组Vero细胞接毒后24 h后就出现CPE现象,48 h内细胞几乎全部死亡,而TG细胞出现CPE和死亡的现象要晚约36 h,而且病变时间较长,这个可能与TG细胞的自我潜伏、复制保护机制有关,与实验预期结果相符。病变开始是TG细胞的突出结构断裂、消失,细胞体积缩小,细胞核变大、核颜色变深、位置边移,细胞的轮形逐渐变圆,随后出现细胞周边变亮和逐步死亡的现象。采用细胞间接免疫荧光技术研究发现:使用两种荧光观察同一个位置,然后两个荧光图片合并,两种荧光所显示的位置相同,分别在第24 h和第48 h都检测到了相应的荧光,在接毒后第48 h比第24 h的荧光明亮更明显,说明PRV感染TG细胞后,PRV能迅速进入TG细胞,而且能在TG细胞内快速复制增殖。进一步通过检测TG细胞培养液中5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）的含量来检测PRV对TG细胞生长的影响,研究发现:对照组中的BrdU含量在生长期间持续升高,达到峰值7.85 pg/m L后逐渐下降,BrdU含量达到峰值的时间是156 h,是TG细胞培养第6～7d的样子,与TG细胞成熟时期相符合。而接种PRV病毒液的实验组的BrdU含量在接毒120 h时立刻下降,而且下降幅度大,接毒PRV后的第12 h,实验组检测值从6.67 pg/mL突然下降到2.81 pg/mL,说明此时的TG细胞分裂速度迅速减慢,甚至有可能是停止分裂,当到达144 h时,BrdU含量降到最低,同时又开始迅速增加,原因可能是TG细胞接毒后期,TG细胞受到PRV的破坏,TG细胞通透性增加或破裂,BrdU陆续释放到细胞外而导致BrdU在感染PRV的后期又有升高的现象。对照组的后期（第8～11 d细胞死亡时）也检测到含量BrdU有反弹上升的现象。2、PRV对三叉神经节细胞NF-кB通路影响的研究将小鼠TG细胞培养至第5 d后接PRV,并设空白对照组,分别在接毒感染后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h取样,用IL-Valukine ^TMM ELISA方法检测IL-1和IL-6的含量变化,IL-1和IL-6都是NF-κB信号通路激活的下游因子,特别IL-1是该通路的标志性炎症因子,通过测量IL-1的含量来推知NF-κB信号通路激活情况。实验结果表明,在接毒36 h时,IL-1的含量开始明显升高,在感染60 h时IL-1的含量达到峰值10.55 pg/mL,实验组IL-6的含量在24 h就达到了峰值165.109 pg/mL,而且对照组中的IL-1和IL-6含量基本没有变化,同时也设计Vero细胞接毒实验进行比较,Vero细胞接毒后24 h IL-1的含量达到峰值9.161 pg/mL,说明TG细胞感染PRV以后产生的IL-1的反应较慢,大约晚36 h,可能是与PRV病毒在神经元细胞的潜伏机制有关,IL-1是细胞炎症因子,IL-1含量达到峰值的时间与细胞开始大量凋亡时间相吻合。实验证明PRV能在感染后期激活TG细胞的NF-κB信号通路,并能通过激活该通路来调节细胞的凋亡。通过合成MyD88和TRIF的siRNA,再利用脂质转染法分别把siRNA转染到培养好的小鼠TG细胞内,分别沉默MyD88和TRIF基因,同时设计空转染组进行对照,转染后24～36 h开始接毒PRV,接毒后第3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h取样,直至接毒细胞大部分细胞死亡,取完后用IL-1 Valukine^TMELISA方法检测IL-1的含量变化,以峰值为参考比较沉默效果,MyD88基因沉默效果分别为21.67%、18.60%和39.52%,TRIF基因沉默效果分别是9.55%和5.86%。进一步进行MyD88基因和TRIF基因同时沉默实验,双沉默效果为27.12%和33.08%。实验结果显示:MyD88基因沉默效果要比TRIF基因的沉默效果好,平均沉默效果高出18.89%,说明MyD88是NF-кB通路激活的途径,NF-кB通路激活是通过MyD88活化途径来激活的。3、PRV对细胞NF-кB通路影响研究的体内验证选择成年小鼠12只,实验组与对照组分别6只,实验组小鼠一次性脑内接活PRV病毒液10μL,同时对照组脑内注射PRV神经元细胞培养液10μL,脑组织接毒后第24h和48 h分别取3只小鼠脑组织,测量脑组织中IL-1的含量变化,实验结果显示:对照组小鼠脑组织的IL-1含量变化不大,实验组中小鼠脑组织的IL-1含量明显升高。按照上述方法取样进行荧光定量PCR检测实验,每个样品分别做3个复孔,根据公式2^一△△ct计算每个样本mRNA的相对表达量,以0 h的结果为参照,对照组24 h转录上调2.35倍,对照组48 h上调4.78倍,接毒组24 h及48 h分别上调了5.82倍和11.61倍,接毒组的p65转录因子含量明显升高,说明PRV感染TG细胞后对p65转录因子的产生起到了直接作用。按照上述方法取样进行Western Blot实验,待测样品上样量均为10μL,总蛋白上样量在20～50μg/孔,通过WB实验得到化学发光图,再利用photoshop软件读出各个印迹的平均灰度值,根据内参蛋白和p65表达蛋白之间的灰度值比例关系计算出p65表达蛋白的相对含量,接活PRV组24 h、48 h时,p65蛋白灰度值/内参蛋白灰度值的比值明显低于对照组和接毒前组的值,比值分别是接毒0 h为1.386、对照组24 h为1.381、对照组48 h为1.379、实验组24 h为1.277、实验组48 h为1.141,接毒组的曲线斜率明显变化,可以说明接毒组中的NF-κB p65蛋白表达量明显升高。小鼠体内验证实验结果与体外实验一致,更进一步验证了本研究结果的可靠性。综上所述,PRV感染TG细胞后,能够迅速进入TG细胞内增殖,并能够使TG细胞产生相应的CPE,同时对TG细胞的生长有很强的抑制作用,该研究进步一证实了该TG细胞的病变与PRV感染有直接的关系。PRV能在感染TG细胞后期激活NF-κB信号通路,而且NF-кB通路激活途径是通过MyD88途径而实现的,该研究不仅可以为深入阐明PRV致病与免疫机理奠定基础,为进一步揭示猪伪狂犬病病毒潜伏感染及其致病机理提供了新的线索,也可为其它疱疹病毒类似科学问题的揭示提供借鉴。