自然界中，各种极端环境下均有生物体存在，如高温、强酸碱性条件、盐度、高压及辐射条件。生存在极端环境下的生物称为极端微生物。各种微生物适应极端环境的机制为研究大多数物种在其生物进程中的基本特征提供了独特的视角。嗜酸微生物是指能够在pH1.0下生长，且在pH小于4.0时活跃生长的微生物，其耐酸的相关机制尚不清楚。　　本论文进行了绳状青霉X33耐酸分子机制的探索。分离得到一株耐酸的绳状青霉X33，该菌具有广泛的生长pH范围，为pH0.6-13.0。利用农杆菌介导转化方法建立了绳状青霉X33转化系统并进行了优化，构建了T-DNA插入突变体库。针对转化过程中4个关键因素，即绳状青霉X33孢子的新鲜程度、预培养培养基和共培养培养基中AS的有无以及浓度、共培养时间、绳状青霉X33孢子悬液和农杆菌菌液的比例，对农杆菌介导绳状青霉X33转化效率的影响建立了高效的生长青霉转化体系。利用该转化系统构建了含有9300株转化子的突变体库，Southern杂交显示转化子基因组中，T-DNA插入拷贝数为1-2个，其中87.7％为随机单拷贝插入。对绳状青霉X33 T-DNA插入突变体库进行表型筛选，发现了几株形态异常的突变子。　　以不耐酸突变体M4为研究对象，利用TAIL-PCR技术，克隆得到一个基因，命名为PfMFS（基因号:KF815490）。经比对，该基因与马尔尼菲青霉(Penicillium marneffeiATCC18224)保守的假想蛋白(XP_002144911)具有88％的同源性。它包含一个1656bp的开放阅读框ORF，编码551个氨基酸。BLASTP分析显示，该基因编码的氨基酸是主要协助转运蛋白超家族(MFS)成员。这些结果显示，该假想蛋白是一种新的MFS转运体，但是其功能尚不清楚。　　序列分析可知，农杆菌转化过程中T-DNA插入在PfMFS基因的启动子区-372。为了进一步确定PfMFS基因在绳状青霉X33耐酸性状中的作用，为此我们采用以同源重组为基础的基因敲除技术，利用农杆菌侵染的转化方法将野生菌的PfMFS基因敲掉，并通过Southern杂交和PCR进行了验证。结果显示PfMFS基因缺失突变株在pH1.0生长极为缓慢，进一步说明PfMFS基因在绳状青霉X33耐酸性状中发挥作用。　　通过回补实验，以质粒p3SR2为骨架构建了回补载体p3SR2-PfMFS，采用电击转化萌发孢子方法，将PfMFS基因重新导入敲除突变体M7，并用RT-PCR、Northern杂交等实验进行验证。该数据说明突变体M4和M7性状的改变是PfMFS基因的作用。　　为了测定绳状青霉X33原生质体体内pH，制备了原生质体，用高效荧光探针BCECF-AM进行测定。敲除突变体M7由于PfMFS基因被破坏，其原生质体内pH较野生菌低。这一结果显示了PfMFS基因在维持绳状青霉X33细胞内pH稳态的重要性。　　为了进一步研究PfMFS基因的生物学功能，进行了异源表达实验。酵母转化子PfMFS-22在pH2.0的YPD培养基上的生长情况好于含空载的酵母，在pH1.0下都不生长，pH3.0生长几乎相同。结果说明，绳状青霉X33 PfMFS基因在低pH下对酸性环境具有抵抗能力。　　绳状青霉X33敲除突变体M7对NaCl不敏感，野生菌在NaCl存在的情况下生长量增加。在原生质体悬浮液pH的测定实验，原生质体悬浮液中加入25mM的NaCl，测其pH，结果显示加入NaCl之后，野生菌的pH显著降低，而敲除突变体几乎不变。结果说明，Na+与PfMFS转运体相关联，PfMFS转运体可能是一个Na+依赖性MFS运转体。　　PfMFS基因的细胞定位，构建了融合表达载体pROKⅡ-GFP-PfMFS，转化农杆菌EHA105，侵染洋葱表皮细胞并在其中进行表达，在荧光显微镜下进行观察，绿色荧光出现在细胞膜的位置，所以PfMFS转运体是一个膜蛋白。