玉米酒发酵过程中微生物多样性及风味品质研究

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玉米酒也称包谷酒(corn wine)是一种贵州特色传统酒,以玉米为原料,采用传统酿酒工艺酿造而成的。玉米酒的发酵是开放环境下多菌种参与的传统发酵。研究玉米酒发酵过程中微生物与挥发性和非挥发性代谢物之间的潜在相关性,挖掘有助于风味物质形成相关的主要功能微生物,为玉米酒的生产和品质控制提供理论依据。目前,关于发酵食品中微生物与风味物质的相关性研究较多,但是在玉米酒当中的应用较少。本文以不同发酵阶段(第0天、第2天、第4天、第6天、第8天和第12天)的玉米酒醅为试验材料,研究玉米酒发酵过程中细菌和真菌的群落组成及演替规律,分析理化指标、有机酸、挥发性风味物质和非挥发性代谢产物之间的动态变化。并利用多元统计分析,揭示对风味物质形成贡献大的核心功能微生物。研究结果如下所示:(1)利用Illumina高通量测序技术对玉米酒发酵过程中微生物多样性和群落组成进行分析发现:细菌共得到819,612个有效序列,真菌共得到932,366个有效序列;细菌的微生物多样性和丰度指数不稳定,真菌的微生物多样性和丰度指数呈下降趋势;在细菌群落中共鉴定出6个细菌门和16个细菌属,其中后壁菌门(Firmicutes),变形菌门(Proteobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势细菌门,芽孢杆菌属(Bacillus)、普氏菌属(Prevotella_9)、不动杆菌属(Acinetobacter)和葡糖杆菌属(Gluconobacter)为优势细菌属;在真菌群落中共鉴定出3个真菌门和5个真菌属,其中子囊菌门(Ascomycota)和毛霉菌门(Mucoromycota)为优势真菌门,根霉菌属(Rhizopus)和酵母菌属(Saccharomyces)为优势真菌属。微生物与微生物的相关性分析网络表明14个细菌属和5个真菌属共产生7个正相关和16个负相关(|r|>0.5,p<0.05),说明在玉米酒发酵过程中细菌和真菌之间的共生作用大于拮抗作用且真菌对于细菌的影响较大。(2)通过对理化指标的动态分析显示,玉米酒发酵过程中不同阶段的温度、pH、总糖、总酸、酒精度、水分含量、淀粉含量及氨基酸态氮存在显著性差异(p<0.05)。在发酵初期微生物的生长繁殖速度较快,随着发酵的不断进行,微生物数量减少,所以温度先上升后下降。总酸和氨基酸态氮的含量分别从0.68±0.05 g/L和0.12±0.02 g/L上升到1.71±0.02 g/L和0.70±0.04 g/L。pH值和总糖的含量分别从6.59±0.02和7.32±0.10 g/L下降到3.73±0.004和0.64±0.04 g/L。采用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用(HS-SPME-GC-MS)技术对玉米酒发酵过程中的挥发性风味物质进行测定,结果表明:在发酵过程中共得到52种挥发性风味物质,包括14种醇类、8种酯类、7种酸类、6种醛类、6种烷烃类、5种酚类、2种烯类和4种其他风味物质。挥发性风味物质的主成分分析(PCA)显示:发酵过程中6个不同阶段的样品发生明显的分离,确定了24个挥发性风味化合物对玉米酒的影响较大。采用高效液相色谱(HPLC)对有机酸进行检测分析,共检测出9种有机酸,其中乙酸和琥珀酸是玉米酒发酵过程中的主要有机酸,其余分别为丙酮酸、草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸和富马酸。苹果酸、丙酮酸、草酸、酒石酸、柠檬酸和富马酸整体呈上升趋势,乳酸呈先上升后下降的趋势。(3)采用气相色谱-飞行时间质谱(GC-TOF-MS)技术对发酵过程中的玉米酒醅进行非挥发性代谢物的研究,结果表明:根据质量控制过滤(光谱相似性值>700),共确定97个可靠代谢物。基于无监督PCA分析发现不同阶段的样品存在明显的区别。基于OPLS-DA模型,共筛选出25种重要显著差异代谢物,其中包括4种有机酸,3种氨基酸,3种多元醇,9种糖和6种其他代谢物(VIP>1.0,p<0.05)。对差异代谢物代谢途径分析和代谢通路富集分析表明,共得到35条代谢途径,其中氨基乙酰-t RNA的生物合成、酪氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、苯丙氨酸的代谢、丙酮酸代谢和甘草酸和二羧酸代谢这8条代谢通路为关键代谢途径。(4)基于冗余分析法(RDA)对微生物与理化指标和相关性分析表明:细菌方面,芽孢杆菌属受到pH、总糖和淀粉含量的影响,葡糖杆菌属只与总酸、水分和氨基酸态氮呈正相关。真菌方面,酵母菌属和威克汉姆酵母菌属(Wickerhamomyces)受到总酸、水分和氨基酸态氮的影响,根霉菌属与淀粉、总糖、总酸、水分和氨基酸态氮呈负相关。基于O2PLS模型对微生物与挥发性风味物质相关性分析表明:共有9个微生物属与52种挥发性风味物质具有关联性(VIP>1.0,p<0.05),分别为葡糖杆菌属、uncultured_bacterium、醋杆菌属(Acetobacter)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、酵母菌属,根霉菌属、威克汉姆酵母菌属和曲霉菌属(Aspergillus)。其中,酵母菌属、根霉菌属、uncultured_bacterium、解硫胺素芽孢杆菌属、威克汉姆酵母属和葡糖杆菌属可能是玉米酒中潜在的风味贡献微生物。通过微生物与非挥发性代谢物之间的相关性分析表明:微生物与非挥发性显著差异代谢物之间共有25个正相关和33个负相关(|r|<0.7,p<0.05)。酵母菌属、uncultured_bacterium、解硫胺素芽孢杆菌属、曲霉菌属、泛菌属(Pantoea)和根霉菌属为核心微生物属。此外,玉米酒发酵过程中的非挥发代谢物(包括有机酸)受真菌的影响较大。
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