主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子可将外源性抗原递呈给 T 辅助细胞,引起抗原特异性 T 细胞的活化。MHC-Ⅱ类分子的组成型表达仅限于“专职性”抗原递呈细胞,但某些细胞因子如 IFN-γ 可诱导非专职抗原递呈细胞表达MHC-Ⅱ类分子。无论是组成型还是诱导型表达 MHC-Ⅱ类分子,MHC-Ⅱ类分子反式激活因子(CⅡTA)都是绝对必需的。近年的研究提示 CⅡTA 是控制 MHC-Ⅱ类基因表达的主宰调节者,决定着 MHC-Ⅱ类分子的存在与否及表达程度,也决定了免疫应答的本质。作为影响一个大基因家族的单个基因或蛋白质,CⅡTA是对 MHC-Ⅱ类分子递呈抗原过程进行干预的理想靶点,可以在自身免疫损伤和移植排异过程中进行免疫抑制干预。 反义核酸技术是根据碱基互补原理,使用可与靶遗传物质(mRNA 或 DNA)特定互补的核酸片段对基因表达进行封闭的技术方法。反义 RNA(antisenseRNA)是反义核酸技术的一种,其下调基因表达的确切机制未明,可能是通过与 mRNA 结合,形成二聚体而干扰特定蛋白的合成,这种结合反应可以发生在转录完成至翻译起始的各个阶段,包括 RNA 的拼接、转运及翻译起始复合物结合至起始密码子。反义核酸片段以重组腺病毒作为基因转移的载体,克服了其稳定性差、细胞穿透性差等缺点,提高了反义核酸进行基因治疗的可行性与有效性。 实验性自身免疫性心肌炎(experimental autoimmune myocarditis,EAM)由于与人类心肌炎具有相似的病理特征与疾病进程,因此常作为研究心肌炎发病机理的动物模型。EAM 是一种 T 细胞介导的以心肌细胞变性、坏死、纤维化并伴有大量单个核细胞浸润为病理特征的免疫性炎症。在心肌组织中,MHC-Ⅱ类分子异常表达,CD4+ T 细胞和巨噬细胞大量局部浸润、预炎因子分泌增加,导致抗心肌肌凝蛋白自身反应性 T 细胞的激活是造成正常心肌损伤的主要原因。因此,有可能通过靶向性抑制 CⅡTA 的表达,下调 MHC-Ⅱ类分子的表达与对自身抗原肽的递呈,达到对 EAM 进行防治的目的。 本研究设计以小鼠 pⅣ型 CⅡTA mRNA 为模板的反义片段,片段全长为431bp,覆盖了起始密码子上游 22 个碱基及阅读框 5’端 409 个碱基,也包含了第一外显子和第二外显子间的剪接位点;用常规分子生物学方法构建了反义片段的腺病毒表达载体(pAdEasy-1 系统);腺病毒载体经 HEK293 细胞包装产生含反 3<WP=7>硕士论文 中文摘要义片段的重组腺病毒 Ad-CⅡTA,用氯化铯密度梯度离心法获得纯化的高滴度腺病毒;采用多种方法对重组腺病毒进行了定量检测与活性评价;并将 Ad-CⅡTA分别感染 HeLa 细胞与 P388D1 细胞,观察其对诱导型与组成型 MHC-Ⅱ类分子表达的抑制;用纯化的猪心肌肌凝蛋白免疫 Balb/c 小鼠,诱导实验性自身免疫性心肌炎动物模型的产生,并分别于免疫后 0～2 天与 14～16 天经尾静脉注射重组腺病毒,观察 Ad-CⅡTA 对实验性自身免疫性心肌炎的预防与治疗效果。 第一部分 携带小鼠 MHC-Ⅱ类分子反式作用因子基因反义片段的 重组腺病毒载体的构建 本部分采用常规分子生物学方法,先从经 IFN-γ刺激的小鼠腹腔单个核巨噬细胞中提取总 RNA,反转录获得 cDNA,根据 Primer3 软件设计的小鼠 pⅣ型CⅡTA 引物 PCR 扩增获得目的片段,经 pMD18-T 载体获得多克隆位点,装载进入重组穿梭质粒 pAdTrack-CMV。以 PmeⅠ酶切带目的片段的穿梭质粒pAdTrack-CMV 后,与重组腺病毒骨架质粒 pAdEasy-1 共转化感受态大肠杆菌DH-5α,发生同源重组获得携带反义片断的重组腺病毒骨架,经鉴定后纯化该骨架质粒,以内切酶 PacⅠ线性化骨架,转染 HEK293 细胞获得完整的重组腺病毒颗粒 Ad-CⅡTA。本部分构建的重组腺病毒载体为进行反义抑制 CⅡTA 基因表达,定量下调 MHC-Ⅱ类分子的表达防治自身免疫性疾病动物模型打下了基础。 第二部分 重组腺病毒的纯化与定量检测 本部分分别通过流式细胞术、噬菌空斑形成试验、半数组织细胞病变法和实时定量 PCR 法、高效液相色谱法、OD260比色法测定了经 CsCl 双密度梯度超速离心纯化的重组腺病毒的感染活性与实际病毒颗粒数。两组方法之间的差距平均不超过 102倍,且两组方法内之间的结果具有明显的可比性,表明了经纯化的重组腺病毒具有较稳定的性质。由于测定感染活性的方法往往缺乏客观的判断标准,且耗时耗力,较易引起误差,而测定病毒实际颗粒数的方法又不能反映病毒的感染活性,因此我们推荐在测定病毒滴度时运用多种方法联合评价。由于我们纯化的病毒活性比较高,为了保持后续实验的重复性,我们使用了实际病毒颗粒数作为剂量标准。 第三部分 腺病毒介导反义 CⅡTA 基因转移抑制 MHC-Ⅱ类分子表达的体外研究 本部分首先使用重组人或鼠的 IFN-γ 分别对细胞株 HeLa 和 P388D1 进行刺激,观察IFN-γ诱导MHC-Ⅱ类分子表达的作用。发现重组人IFN-γ能够诱导HeLa细胞表达 MHC-Ⅱ类分子,且随剂量的增大而使其表达升高。但重组鼠 IFN-γ 对P388D1 细胞 MHC-Ⅱ类分子的表达则没有明显的诱导作用。分别用重组腺病毒