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橡胶树作为植物生物反应器理想场所，其乳管系统中表达外源蛋白具有易收获，易分离纯化等诸多优点。而要达到这一目的，则必须分离乳管特异表达的启动子。本研究首先克隆680bp的hevein基因cDNA片段。测序结果表明该680bp片段含一个开放阅读框架，编码204个氨基酸，其中N端17个氨基酸为信号肽，中间43个氨基酸为Hevein成熟肽，C端144氨基酸为未知功能多肽。然后克隆了526bp的ref cDNA片段。其中编码区414bp，编码138个氨基酸，3’端非编码区112bp。 在分离hevein基因，ref基因的基础上，通过基因步移法分离了hevein基因5’端1306bp序列(Gene Bank登录号：AF327518)。以promoter prediction软件进行基础启动子的分析，发现在865～909，1147～1189处存在可能的基础启动子区域。对该序列以Plant core软件进行顺式作用元件分析，发现Atl-motif，HSE，I-box，ABRE，ERE，EIRE等元件。同样，通过基因步移法分离ref基因5’端763bp序列(Gene Bank登录号：AF380139)。其中，启动子区域的序列长378bp，409～706为内含子序列。通过promoterprediction软件进行基础启动子的分析，结果表明在219～268处存在可能的基础启动子区域。对该序列以Plant core软件进行顺式作用元件分析，发现Atl-motif，HSE，I-box，WUN-motif，P-box，G-box等元件。 同样，通过基因步移法分离hmgl基因5’端317bp序列。其中，启动子区域的序列长258bp。通过promoter prediction软件进行基础启动子的分析，结果表明在155～205处存在可能的基础启动子区域。对该序列以Plant core软件进行顺式作用元件分析，发现CGTAC-motif，HSE，I-box，G-box等元件。 随后，通过PCR的方法对hevein基因5’端1306bp的序列进行系列缺失，并通过取代pBI121上35S启动子序列，构建了含GUS基因的嵌合植物表达载体：pBIH1(1241bp)，pBIH2(805bp)，pBIH3(348bp)，pBIH4(224bp)。ref基因启动子也通过类似的方法，构建了含GUS基因的嵌合植物表达载体：pBIR1(378bp)。 这些嵌合植物表达载体，pBI121，以及不加载体的阴性对照3day后在胶乳中体外瞬时表达检测结果表明：pBIH1(1～1241)，pBIH2(436～1241)兰色较明显，说明1241bp和805bp的hevein基因启动子片段在胶乳中具有较强的启动能力。pBIH3(893～1241)，pBIH4(1016～1241)，pBIR1，pBI121以及阴性对照无兰色显现。 ABA具有诱导嵌合植物表达载体表达的作用。附加0.1％ABA的样品1day后的观 2 邓晓东橡胶树乳管特异表达基因heve主n、ref启动子研究察结果显示。pBIHI，pBIHZ，pBIH3，pBIRI有较明显的 GUS活性。而 pBllZI，pBIH4以及阴性对照无明显的GUS活性。 pBIHZ通过基因枪转化橡胶树叶片瞬时表达检测结果表明：pBIHZ包被的微弹轰击的叶片，沿着叶脉清晰地被染成兰色，侧脉也有微弱的兰色。PBllZI包被的微弹轰击的叶片，在叶脉处无兰色显现，在薄壁细胞处有分散的兰色斑点。对照叶片无兰色显现。此结果说明hevein启动子的乳管表达特异性。 在pBMZ通过农杆菌转化烟草的研究中，共得到Kan抗性苗28株。对25株Kan抗性茵进行了 PCR检测，检测结果表明：转 pBIHZ的烟草植株，在约 800 hp的位且有目的片段扩增出来。共有15株PCR检测呈阳性。将PCR检测呈阳性的15株植株进行GUS的组织化学分析，结果显示：pBIHZ转化的烟草植株，在叶肉，叶脉和根中均未检测到GUS的活性。这一结果说明pBIHZ在薄壁细胞，韧皮部，维管束的组织中不表达，从侧面验证了pBIHZ的乳管表达特性。