目的本研究拟通过体外压力培养平台,分析不同压力梯度下角膜内皮细胞的形态和结构特点,以及其生物学功能的变化规律。探讨正常眼压对角膜内皮细胞活性的正向调节作用,为建立旨在提高角膜内皮细胞培养质量的三维仿生培养系统提供理论依据,构建工程化角膜内皮细胞移植膜。阐明病理性高眼压下角膜内皮细胞损伤的病理基础和调控环节,为青光眼治疗策略中的内皮细胞保护提供实验依据。方法第一部分角膜内皮细胞培养技术的改良将带有兔角膜内皮细胞的后弹力层完整撕下,胰蛋白酶-EDTA联合酶化,纯化的角膜内皮细胞进行体外培养。倒置显微镜下观察细胞形态,描记细胞生长倍增曲线。神经元特异性烯醇化酶抗体进行细胞表型鉴定。苏木素-伊红(HE)染色以及茜素红-台盼兰联合染色分析细胞活性,流式细胞仪检测细胞体外生长过程中AnnexinⅤ-PE的表达情况,透射电镜和扫描电镜进行细胞超微结构形态的观察。第二部分角膜内皮细胞压力仿生培养的研究设计并制作自动充压范围为0～60mmHg的压力维持培养装置,测定预设压力的维持时间,确定自动充压的时间点。将接种了传代角膜内皮细胞的培养板放入压力预设为2KP(14.66mmhg)的压力维持培养装置中,进行持续培养。观察细胞的形态,形成单层的时间,描记细胞倍增曲线。形成单层后茜素红-台盼兰联合活性染色评价细胞活性,正常压力培养过程中,激光共焦显微镜检测细胞连接蛋白ZO-1表达部位和表达强度,评价细胞间连接功能的建立情况。免疫荧光法追踪Caspase-3表达,流式细胞技术检测压力培养下AnnexinV-PE阳性细胞的比例。第三部分三维压力仿生培养构建工程化角膜内皮细胞移植膜胰酶消化去除羊膜上皮细胞,保留基底膜作为载体,接种纯化兔角膜内皮细胞,在压力培养系统中,进行三维仿生培养,构建工程化角膜内皮细胞移植膜。HE染色,电镜观察构建移植膜的组织结构及形态,免疫荧光分析ZO-1蛋白的表达。第四部分高压力作用下角膜内皮细胞损伤机制研究增压培养装置内给予持续高压3.2kp～4.6kp (24.06mmhg～34.59mmhg)、5.4kp～6.8kp(40.60mmhg～51.29mmhg),观察角膜内皮细胞形态以及增殖活性的变化,评估角膜内皮细胞生物学活性与压力强度以及持续时间的相关性,检测早期凋亡因子Caspase-3、AnnexinV的表达规律。结果1.后弹力层撕除联合酶消化法获得大量纯化的角膜内皮细胞,快速贴壁生长并增殖,体外培养3～4 d即融合成单层细胞,表达神经元特异性烯醇化酶抗体阳性, HE染色及活性染色提示细胞功能良好。2.生理压力环境培养下的角膜内皮细胞生长活性良好,细胞立体感强、外形扁平,细胞间连接紧密,细胞膜及交界区ZO-1蛋白高水平表达,更接近机体生理状态下生长的内皮细胞。生理压力下未见明显的细胞凋亡现象。3.压力培养系统中,角膜内皮细胞接种于脱细胞羊膜后,快速生长并增殖,3～4d即融合成单层,其形态及生长密度优于单纯培养皿上培养的内皮细胞。HE染色及电镜显示构建的工程化内皮植片具有与生理角膜内皮组织相近的组织结构。4.高压环境下培养的角膜内皮细胞,增殖缓慢,胞体大而透明,胞浆内含较多的颗粒,细胞间隙增宽。随着培养时间的增长,Caspase-3、AnnexinV表达增强,凋亡细胞比例显著增加。结论1.角膜后弹力层撕除联合酶消化法可提高角膜内皮细胞的获取和培养效率,该方法提取的角膜内皮细胞纯,细胞数量较多,细胞生长良好,同时减少了上皮、基质引起细胞性污染的风险,为工程化角膜内皮移植膜的构建提供稳定的种子细胞来源。2.低压力仿生培养环境,对角膜内皮细胞的功能有正向调节作用,可促进体外培养角膜内皮细胞之间连接功能的建立,为工程化角膜内皮移植膜的构建提供了新的环境模式诱导平台。3.低压力三维仿生培养系统中,以脱细胞羊膜为载体,可构建细胞密度、形态以及组织结构与生理内皮相似的工程化内皮细胞移植膜,为角膜内皮细胞移植研究进行了前期技术储备。4.高压力对角膜内皮细胞有损伤作用,通过引起细胞凋亡的途径来实现,呈现出时间-量效曲线,Caspase-3、AnnexinV是细胞凋亡启动的关键因子。