乳果糖是一种不易消化的二糖,作为益生性食品添加剂和治疗慢性便秘和肝性脑病的药物,广泛应用于食品和医药领域。目前商业化乳果糖主要是乳糖在碱性溶液中通过化学异构化获得,需要大量的化学催化剂而且反应条件一般比较激烈,得到的产品色泽深,副产物多,且催化剂分离困难,制约了化学异构法生产乳果糖的进一步发展。在过去的几十年,研究者致力于酶法制备乳果糖的研究,可以催化乳果糖合成的酶主要有β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)和纤维二糖差向异构酶((CEs,EC5.1.3.11)。本论文从不同方面研究了Kluyveromyces lactisβ-半乳糖苷酶(KlβGal)和Caldicellulosiruptor saccharolyticus纤维二糖差向异构酶(Cs CE)催化合成乳果糖。β-半乳糖苷酶同时具有水解糖苷键和转糖苷活性,其转糖苷活力能够将乳糖的半乳糖苷转移到乳糖、果糖等受体上,合成低聚半乳糖、乳果糖等功能性低聚糖。本论文首先研究了在果糖存在条件下,β-半乳糖苷酶的转糖苷反应。通过对反应液的HPLC检测,得到两个主要的产物峰。利用半制备色谱柱,对两个产物峰进行分离纯化,得到的纯化产物经液相-质谱、一维与二维核磁共振进行结构鉴定。谱图结果显示,在果糖存在条件下,β-半乳糖苷酶转糖苷反应的主要产物为异构乳果糖(β-D-半乳糖基-(1→1)-β-D-果糖),在重水中有两个主要的异构体,β-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-β-D-吡喃果糖和β-D-吡喃半乳糖基-(1→1)-β-D-呋喃果糖。乳果糖(β-D-半乳糖基-(1→4)-β-D-果糖)为次产物。结果表明,在果糖存在条件下,β-半乳糖苷酶对果糖的C-1羟基具有特定选择性。在制备海藻酸钙(Alg)胶囊过程中,在Ca Cl2溶液中添加1.0%w/v明胶诱导磷酸钙的生成,制备海藻酸盐-明胶-磷酸钙(AGCa P)杂化胶囊,并用于包埋β-半乳糖苷酶。这是首次在环境温度和中性p H的条件下,明胶作为模板引起磷酸钙的瞬间聚集用于酶的固定化。研究并对比了AGCa P杂化胶囊和Alg胶囊的表面形态,溶胀性能和机械稳定性,结果显示仿生的磷酸钙壳壁大大地提高了胶囊的机械稳定性,降低了胶囊溶胀性能,提高了固定化效率并有效抑制了β-半乳糖苷酶的泄露。包埋于AGCa P胶囊的β-半乳糖苷酶连续使用20次以后,酶活仍保持60%以上,存放30天以后,酶活仍然保持在90%左右。同时,与游离的及包埋于Alg胶囊的β-半乳糖苷酶相比,固定于AGCa P的β-半乳糖苷酶具有最广的温度和p H适用范围。38°C,p H 6.8,乳糖和果糖浓度分别为250 mg/m L条件下,反应3 h后,包埋于AGCa P胶囊的β-半乳糖苷酶催化转糖苷反应分别生成26.1 mg/m L乳果糖和74.2 mg/m L 1-乳果糖。Cs CE属于N-酰基-葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)超家族,通常催化纤维二糖和乳糖的葡萄糖基C-2位差向异构化反应,分别生成4-O-β-D-吡喃葡萄糖基-D-甘露糖和依匹乳糖(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-甘露糖)。除了差向异构化反应,Cs CE还可以催化乳糖合成乳果糖(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖)。Cs CE克隆到大肠杆菌并进行表达,通过离子交换色谱柱,疏水作用色谱柱和排阻色谱进行纯化。在80°C,p H 7.5条件下,纯化的Cs CE催化合成乳果糖的比酶活和热失活半衰期分别为10.8 U/mg和141.4 min。Cs CE的催化过程不需要金属离子,辅酶或核苷酸。Cs CE为醛糖-醛糖差向异构酶,并具有醛糖-酮糖异构化活力,可以通过一个反-烯二醇中间体催化乳糖直接异构化为乳果糖。重组Cs CE催化乳糖转化为56.9%的乳果糖和16.3%的依匹乳糖。酶活较低以及生成副产物依匹乳糖等缺点限制了Cs CE催化乳果糖合成的工业化应用。由于Cs CE的晶体结构信息及催化异构化反应的机制还未知,所以选用随机突变的定向进化技术提高Cs CE合成乳果糖的性能。首先确立了96孔板筛选纤维二糖差向异构酶异构化酶活的方法,通过四代连续随机突变与筛选,得到的第四代突变体G4-C5异构化酶活提高2.8倍,kcat/Km提高了约3倍。在酶活提高的同时,突变体G4-C5的热失活半衰期比野生型Cs CE略高,说明定向进化在提高酶活的同时有可能提高其热稳定性。DNA测序结果显示,突变体G4-C5含有5个氨基酸替代,R5M,A12S,I52V,K328I和F231L。在接近饱和的乳糖溶液中(500 g/L乳糖),突变体G4-C5催化乳糖转化为乳果糖的转化率大约为76%,反应溶液中没有检测到副产物依匹乳糖的生成。以上结果表明,随机突变结合高速筛选过程可以有效提高酶的催化性能,与野生型酶相比突变体G4-C5更适合乳果糖的生产。使用悬滴法获得野生型Cs CE和突变体G4-C5的结晶,野生型酶结晶效果最好的条件为0.1 M柠檬酸钠p H 5.6,10%v/v 2-丙醇,10%w/v聚乙二醇4000;突变体G4-C5效果最好的结晶条件为0.2 M氯化镁,0.1 M HEPES缓冲液p H 7.5,30%w/v聚乙二醇400。野生型Cs CE与突变体G4-C5的最高分辨率分别为1.54?与1.67?。晶体结构显示Cs CE为单体酶,三维结构为由12个α-螺旋(H1-H2)组成的(α/α)6桶状结构,与AGE超家族其它的酶具有同源性。12个α-螺旋以一上一下的形式围成桶状,中间形成一个很大的凹洞裂缝,为可能的活性中心。通过同家族氨基酸序列及三维空间结构比对,对保守基团Arg56、Tyr114、Asn184、His188、Glu191、His247、Glu250、Glu312、Glu377、Arg380、Trp308和Trp372进行定点突变与酶活分析,发现Arg56、His188、Glu191、His377、Glu312、Trp308和Trp372等对异构化酶活很重要。基于催化性质与结构信息,推测Cs CE可能执行不需要金属辅因子的以烯二醇为中间体的去质子化/质子化催化机制,His377和His188为异构化反应可能的酸/碱催化基团。突变体G4-C5的三维结构显示,三个氨基酸替代A12S,R5W和K328I位于酶蛋白表面区域,并且远离活性中心。另外一个氨基酸突变F231L也在蛋白质表面,但靠近活性中心裂缝入口。氨基酸突变I52V位于形成活性中心的α-螺旋上,与保守基团Arg56通过氢键相连,且在空间上临近Tyr114和Trp372。根据已解析的Cs CE的三维结构,通过理性设计或计算机辅助设计提高Cs CE的热稳定性。共设计了八个单点突变,S99P,T110G,S180P,S304G,S351G,E94G,E161D以及N365P。其中80°C热失活半衰期延长的突变体为S180P,S351G,E94G,E161D和N365P。将热稳定性提高的突变体相互组合,构建九个组合突变体,其中热稳定性最高的突变体为E161D/N365P,其在80°C半衰期提高将近4倍,最适温度由80°C提高到87.5°C。第二稳定的突变体为E161D/S180P/S351G,80°C半衰期提高到462.7 min。突变体E161D/N365P催化乳糖异构化为乳果糖的比酶活为12.06 U/mg,kcat/Km为0.0909s-1 m M-1,分别为野生型酶的1.12倍与1.29倍。在盐酸胍体系中变性的微量热研究结果显示,野生型酶50%变性的盐酸胍浓度(Cm)约为3.0 M,突变体E161D/N365P的Cm提高到3.5 M,表明在热稳定性提高的同时E161D/N365P具有更强的化学稳定。