在我国民间,许多动植物作为药用和食用,有的甚至作为“滋补品”食用,这些动植物往往含有毒性成分,甚至是剧毒成分,其治疗量与中毒量接近,因用药不当、盲目和超量服用可造成中毒和死亡。在司法鉴定实践中,由此导致的各类误服、自杀、投毒、医疗纠纷等的案件时有发生。由于有毒动植物所含成分复杂多样、毒性大、含量低以及在人体内代谢迅速、且中毒无特异性临床表现等问题,使复杂生物体系中有毒动植物成分的鉴定成为长期以来未能有效解决的技术难题,对有毒动植物中毒的法医学鉴定、临床诊治以及食品安全监测缺乏有效的检测手段和科学的评判依据。现代分析技术的发展使得复杂生物体系中有毒动植物成分的检测和中毒鉴定成为可能。近年来,液相色谱—质谱联用法在法医和临床毒物分析领域的应用得到迅速发展。具有液相色谱高效的在线分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度的检测能力的液相色谱-质谱联用法,可以同时得到化合物的保留时间、分子量以及特征结构碎片等丰富的信息,尤其是串联质谱可从复杂基质中确认目标物,采用选择离子监测或多反应监测模式,更可大大提高分析的专一性和灵敏度,完全有望解决复杂生物体系中痕量有毒动植物成分的检测,并在分析目标物不明确或系统中可能存在数种不同性质的目标物时,用一个分析系统同时检测多种不同性质的目标物。同时液相色谱-质谱联用法分析目标物范围广,前处理简单,不需衍生化,体现出比气相色谱-质谱联用法更灵敏、有效的检测手段,从而对复杂生物体系中的有毒动植物成分的鉴定和确认提供科学依据。本课题以血液、尿液和组织为主要生物检材,研究、探索、建立了22种常见有毒生物碱成分系统筛选方法,乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、秋水仙碱和河豚毒素的定性定量方法,并对乌头碱、新乌头碱、次乌头碱和秋水仙碱的定量分析方法进行了全面、系统的方法有效性验证,解决了LC-MS/MS分析中的样品处理、色谱分离及优化、质谱条件的选择与优化等关键技术问题,同时对它们在急性中毒豚鼠的体内分布进行探讨,并成功地将所建方法应用于司法鉴定实践,为涉毒案件的审理提供了科学证据。具体研究内容如下:一、建立了基于LC-MS/MS-MRM技术的血液中22种有毒生物碱成分的筛选体系和确证方法。目标物涵盖了在实际检案工作中常见的有毒生物碱。所建方法简便、快速、灵敏度高、专一性强,色谱分离采用两根不同性能的色谱柱,使目标物的分离、检测灵敏度、检测所需时间等方面得到互补,整个过程可在16min内完成。最低检测限除羟基喜树碱稍高(20ng/mL)外,绝大多数的LOD足以满足法医毒物学和临床药物学中中毒或治疗浓度目标物的检测要求。二、乌头生物碱的中毒、检测及应用1.建立了测定血液、尿液和组织中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的LC-MS/MS-MRM分析方法,并对其定量方法进行了全面系统的方法有效性验证,内容包括考察方法的线性范围、最低检出限、精密度、回收率、准确度、基质效应、稳定性等,取得了满意的结果。所建方法简便、快速、灵敏,适用于体内痕量乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的检测。2.研究了乌头碱在急性中毒豚鼠的体液和组织中的分布。取豚鼠8只,以1.0-4.0mg/kg剂量灌胃给药致豚鼠乌头碱急性中毒,解剖后取体液和组织进行乌头碱测定。乌头碱在体液和组织中的含量从大到小依次为:胆汁＞血液＞尿液＞胃＞肺＞心＞脾＞肾＞胰＞肝。血液可作为乌头碱中毒、死亡分析的首选生物检材。3.将所建方法成功地应用于鉴定实践,对生物检材中痕量乌头生物碱的成分进行定性定量分析,并对多起乌头植物中毒尸体中体液和组织中的乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量进行测定,首次报道了新乌头碱和次乌头碱在尸体组织中分布,为涉及乌头中毒案件的死因判定和案件的审理提供了明确的方向和科学的证据。三、秋水仙碱的中毒、检测及应用1.建立了测定血液、尿液和组织中秋水仙碱的LC-MS/MS-MRM分析方法,并对其定量方法进行了全面系统的方法学验证,内容包括方法的线性范围、最低检出限、精密度、回收率、准确度、基质效应、稳定性等,所得结果符合法医毒物分析的要求。所建方法简便、快速、灵敏,最低检出限可低至0.05ng/mL,能够满足法医毒物分析和临床毒物分析的要求。2.研究了秋水仙碱在急性中毒豚鼠体内的分布。取豚鼠5只,以4.0mg/kg剂量灌胃给药致豚鼠秋水仙碱急性中毒,解剖后取体液和组织进行秋水仙碱含量测定。秋水仙碱在体液和组织中的含量从大到小依次为:胆汁＞尿液＞脾＞胃＞肺＞肾＞心＞胰＞肝＞肾上腺＞睾丸,心血中秋水仙碱的含量最低。尿液可作为秋水仙碱分析的首选生物检材。3.将所建方法成功地应用于鉴定实践,对中毒尸体的生物检材及野生植物中秋水仙碱的成分进行定性定量分析,为涉及有毒植物中毒案件的死因判定提供了明确的方向和证据。四、生物检材中河豚毒素的检测及应用建立了测定血液、尿液和组织中河豚毒素的LC-MS/MS-MRM测定方法,考察了方法的线性范围及最低检出限。并将所建方法应用于食用河豚鱼中毒的实际案例中,取得了满意的效果。本研究的创新点及研究的意义如下:1.建立的有毒生物碱成分筛选分析方法简便、灵敏,避免了生物检材中该类物质用传统方法检测可能出现的漏检、错检现象,整个分析可在16min内完成。筛选目标物涵盖了司法鉴定中常见的有毒生物碱成分,且LC-MS/MS筛选体系可随着目标物的增加而不断扩充,从而实现对更多的目标物进行筛选。该方法为首创方法。2.全面系统地阐述了生物检材中定量方法的有效性验证,规范了方法的评价指标,通过对生物检材中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱和秋水仙碱的检测方法的有效性验证,证明了所建方法准确、灵敏、专属、重现和可靠。3.建立了生物检材中乌头生物碱LC-MS/MS-MRM分析方法。首次报道了乌头中毒尸体中与乌头碱共存的新乌头碱和次乌头碱的体内分布,为涉及有毒植物中毒案件的死因判定提供了明确的方向和证据。4.建立了生物检材中秋水仙碱LC-MS/MS-MRM分析方法。所建方法足够灵敏,最低检出限可低至0.05ng/mL,能够满足法医毒物分析和临床毒物分析的要求。5.建立了生物检材中河豚毒素的LC-MS/MS-MRM测定方法,并首次报道了河豚鱼中毒尸体中河豚毒素在各组织中的分布情况。研究成果填补了体内有毒动植物检测及评判的空白,使我国的复杂生物体系中常见有毒动植物成分分析技术跃升到国际先进水平,将为有毒动植物的科学研究、中毒鉴定、临床诊断及救治、食品安全监测等提供技术平台。