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第一部分MSCs移植抑制新生HIBD大鼠海马星形胶质细胞增殖目的:明确间充质干细胞（MSCs）及其来源的白细胞介素-6（IL-6）对新生缺氧缺血性脑损伤（HIBD）大鼠海马星形胶质细胞增殖的作用及其可能作用机制。方法:选取新生7 d龄SD仔鼠,经左侧颈总动脉结扎及缺氧2.5 h构建HIBD损伤模型,5 d后行MSCs侧脑室移植。Morris水迷宫和新事物探索实验评估MSCs移植对新生HIBD大鼠学习记忆功能的修复作用。HIBD损伤7 d、14 d及21 d后,免疫荧光染色动态观察新生HIBD大鼠海马星形胶质细胞的增殖状况,ELISA检测大鼠海马组织中IL-6表达水平。体外培养大鼠原代星形胶质细胞,构建氧糖剥夺（OGD）损伤的星形胶质细胞与MSCs分离共培养模型。流式细胞仪分析MSCs分离共培养后OGD损伤星形胶质细胞的细胞周期进程。ELISA检测体外细胞分离共培养上清中IL-6分泌水平。Western blot检测HIBD大鼠海马组织和体外OGD损伤星形胶质细胞中IL-6受体gp130、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶α（p-AMPKα）、磷酸化的雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）及其下游信号分子的蛋白表达水平。免疫共沉淀（Co-IP）及免疫荧光染色测定gp130与p-AMPKα或p-mTOR蛋白之间相互作用。结果:（1）Morris水迷宫训练结果显示,MSCs移植组大鼠较HIBD组在训练2-5 d内找到平台的时间显著缩短(**P<0.01),第6 d探索实验中穿越平台所在区域次数也明显增多（*P<0.05）。在新事物探索实验中,MSCs移植组大鼠对更换位置物体的探索时间显著长于HIBD组大鼠(**P<0.01)。上述功能学检测结果表明MSCs移植可促进HIBD大鼠学习记忆能力的修复。（2）免疫荧光双染色发现,MSCs移植显著减少HIBD后7-14 d海马组织中ki67+/GFAP+双标细胞数量（*P<0.05）。（3）与MSCs分离共培养后的OGD损伤星形胶质细胞中S期细胞比例较OGD组显著减少(**P<0.01)。（4）MSCs侧脑室移植增加HIBD大鼠海马组织IL-6表达水平(**P7d<0.01,***P14d<0.001,***P21d<0.001),而体外分离共培养体系中IL-6水平也显著增高(**P<0.01)。（5）MSCs干预后,HIBD海马组织及OGD损伤的星形胶质细胞中gp130和p-AMPKα蛋白表达水平显著升高,但mTOR及其下游靶点p70S6K、4E-BP1蛋白磷酸化水平却明显降低(***Pgp130<0.001,***Pp-AMPK<0.001,*Pp-mTOR<0.05,***Pp-p7S6K<0.001,***Pp-4E-BP1<0.001)。（6）MSCs分离共培养促进OGD损伤星形胶质细胞中gp130与p-AMPKα之间的蛋白-蛋白相互作用。结论:MSCs体内移植及体外分离共培养均可增加损伤微环境中IL-6分泌水平,激活AMPK/mTOR信号通路,抑制HIBD损伤7-14 d大鼠海马星形胶质细胞增殖,促进HIBD大鼠学习记忆能力修复。第二部分MSCs内源IL-6抑制新生HIBD大鼠海马星形胶质细胞增殖的调控机制第一章沉默内源IL-6削弱MSCs对HIBD大鼠海马星形胶质细胞增殖的抑制作用目的:运用si RNA干扰技术沉默MSCs中IL-6表达,通过体内外实验证实MSCs内源性IL-6抑制HIBD大鼠海马星形胶质细胞增殖中的作用机制。方法:7 d龄仔鼠HIBD损伤后5 d,随机行侧脑室注射si IL-6 MSCs或si RNA-control MSCs细胞悬液。分别在HIBD损伤7 d、14 d及21 d后,ELISA检测大鼠海马组织IL-6表达水平,同时ki67+/GFAP+免疫荧光双染监测大鼠海马组织中增殖的星形胶质细胞数量。在HIBD大鼠4 w龄和5 w龄时分别行Morris水迷宫和Object-in-place,检测两组大鼠的神经功能状况。将OGD损伤的大鼠原代星形胶质细胞分别与si IL-6 MSCs或si RNA-control MSCs分离共培养24h,流式细胞仪分析两组星形胶质细胞S期的比例。ELISA检测两组分离共培养上清中IL-6分泌水平。Western blot检测海马组织及共培养后的星形胶质细胞gp130、p-AMPKα、p-m TOR、p-p70S6K及p-4E-BP1蛋白表达水平变化。结果:（1）si IL-6 MSCs移植显著下调HIBD大鼠海马组织IL-6表达水平（**P7d<0.01,***P14d<0.001,***P21d<0.001）。（2）Morris水迷宫行为学检测显示,si IL-6 MSCs移植组大鼠在训练5 d内找到平台的时间较si RNA-control MSCs对照组大鼠明显延长（***P<0.001）,而在第6 d的平台探索期穿越平台所在区域的次数也显著减少（**P<0.01）。在Object-in-place实验中,si IL-6 MSCs移植组大鼠对互换位置物体的探索时间明显少于si RNA-control MSCs对照组（*P<0.05）。提示沉默MSCs中IL-6表达水平不利于HIBD大鼠学习记忆功能改善。（3）免疫荧光双标染色发现,在HIBD损伤后7-14 d,si IL-6 MSCs移植组大鼠海马中ki67+/GFAP+双标细胞明显多于si RNA-control MSCs对照组（*P<0.05）。（4）与si IL-6 MSCs分离共培养后的OGD损伤星形胶质细胞处于S期的细胞数量较对照组显著增多（*P<0.05）。（5）与si IL-6MSCs分离共培养后的细胞培养上清中IL-6分泌水平显著降低（***P<0.001）,且与si IL-6 MSCs共培养后的OGD损伤星形胶质细胞中gp130和p-AMPKα蛋白表达水平均明显降低,而p-m TOR、p-4E-BP1及p-p70S6K蛋白表达水平却显著升高（**Pgp130<0.01,*Pp-AMPK<0.05,***Pp-m TOR<0.001,**Pp-p7S6K<0.01,*Pp-4E-BP1<0.05）。si IL-6 MSCs移植后,HIBD大鼠海马组织中gp130、p-AMPKα、p-m TOR、p-4E-BP1及p-p70S6K蛋白的表达变化趋势与体外检测结果基本一致。结论:si IL-6 MSCs移植或分离共培养均可减低损伤微环境中IL-6表达水平,沉默内源性IL-6表达水平减弱了MSCs对星形胶质细胞增殖的抑制作用,降低了MSCs促进HIBD大鼠学习记忆功能的修复功能,而AMPK/m TOR信号通路未得以激活,进一步支持内源性IL-6在MSCs治疗HIBD中的重要性。第二章阻断m TOR信号抑制新生HIBD大鼠海马星形胶质细胞增殖目的:利用m TOR特异性抑制剂雷帕霉素进行干预,明确m TOR在HIBD大鼠海马星形胶质细胞增殖中的调节作用。方法:新生7 d仔鼠经HIBD损伤后,m TOR特异性抑制剂雷帕霉素连续腹腔注射7 d,每日一次。Western blot检测雷帕霉素干预后HIBD大鼠海马组织m TOR蛋白表达水平变化。Morris水迷宫、Object-in-place行为学实验分别检测雷帕霉素干预后的HIBD大鼠空间学习记忆及新事物探索能力。免疫荧光染色观察干预后的HIBD大鼠海马增殖的星形胶质细胞数量。CCK-8试剂盒监测雷帕霉素干预后的6 h、24 h、48h、96 h、120 h OGD损伤星形胶质细胞的增殖速率,流式细胞仪及钙影像系统分别检测干预24 h后S期的OGD损伤星形胶质细胞比例及胞内Ca2+水平。Western blot检测雷帕霉素处理后OGD星形胶质细胞中gp130、p-AMPKα、p-m TOR、p-4E-BP1及p-p70S6K蛋白表达水平变化。结果:（1）雷帕霉素可有效抑制HIBD大鼠海马组织中m TOR的蛋白表达水平。（2）Morris水迷宫训练中发现雷帕霉素干预的HIBD大鼠找到平台所用时间短于HIBD+vehicle对照组（***P<0.001）,第6 d穿越平台所在区域次数显著多于对照组（***P<0.001）。同时发现雷帕霉素处理组大鼠探索新事物能力较对照组明显增强（*P<0.05）,表明抑制m TOR有助于改善HIBD大鼠学习记忆功能。（3）雷帕霉素干预后,HIBD大鼠海马中GFAP+/ki67+双染细胞数量（**P<0.01）及GFAP的蛋白表达水平均显著减少,干预后的OGD损伤星形胶质细胞的增殖速率明显减少,S期细胞比例下降（**P<0.01）,ATP诱导的损伤细胞胞质内Ca2+浓度显著降低（***P<0.001）。（4）体外雷帕霉素干预还可显著降低损伤细胞内的p-m TOR、p-4E-BP1及p-p70S6K蛋白表达水平(（***Pp-m TOR<0.001,**Pp-p7S6K<0.01,***Pp-4E-BP1<0.001）,但对gp130和p-AMPKα的蛋白表达无影响。结论:阻断m TOR可减少HIBD大鼠海马及OGD损伤星形胶质细胞的增殖,降低p-m TOR及其下游的p-4E-BP1及p-p70S6K蛋白表达水平,从而改善HIBD大鼠学习记忆功能。第三部分氧糖剥夺激活星形胶质细胞NFκB/IL-10信号抑制神经元凋亡目的:探讨星形胶质细胞分泌IL-10对神经元的生物学作用及具体分泌机制。方法:构建大鼠星形胶质细胞OGD损伤模型,免疫荧光检测星形胶质细胞中p-NFκB p65的表达。Annexin V-FITC/PI染色检测外源性重组大鼠IL-10干预后OGD损伤神经元的凋亡情况。构建不同长度的IL-10启动子荧光素酶报告基因质粒,检测p-NFκB p65与IL-10启动子不同区域的结合情况。将新生7 d的SD仔鼠构建HIBD模型,免疫荧光检测海马星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元中TLR2及IL-10的表达情况。结果:（1）外源性重组大鼠IL-10处理可减轻OGD损伤神经元的凋亡水平（**PFITC+<0.01,**PPI+<0.01）,但对OGD损伤的星形胶质细胞凋亡无影响。（2）OGD损伤诱导星形胶质细胞中p-NFκB p65在细胞核内的表达水平增加。（3）OGD损伤的星形胶质细胞中p-NFκB p65可与IL-10基因启动子-1700/-1000 bp近端区域相结合（***P-1700/-1500<0.001,*P-1500/-1000<0.05）。（4）HIBD损伤主要诱导海马星形胶质细胞中TLR2及IL-10的表达增强（*P<0.05）。结论:上述研究结果结合我们前期的数据表明,OGD损伤激活星形胶质细胞中TLR2/NFκB信号通路,促进IL-10分泌;IL-10通过旁分泌作用抑制OGD损伤神经元的凋亡。