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目的:观察大鼠脑缺血预适应中自噬的激活,探讨自噬激活在脑缺血预适应诱导的神经保护中的作用,以及脑缺血预适应模型中自噬与内质网应激、热休克蛋白HSP70之间的内在联系,探索自噬诱导剂能否模拟缺血预适应的生物效应用于防治缺血性脑中风引起的神经损伤。方法:本实验中采用两次插入线栓的方法制备局灶性脑缺血预适应模型;首次预缺血(IPC)时间为10 min,预缺血10 min后拔出线栓实现再灌,24 h后行再次插入线栓永久性阻塞大脑中动脉(PFI),自噬抑制剂3-methyladenin (3-MA)、自噬激活剂rapamycin(雷帕霉素)侧脑室注射给药,通过神经症状评分、脑梗塞体积、脑含水量测定以及脑组织形态学检测脑损伤程度。用电镜观察大鼠脑缺血预适应模型中自噬激活和内质网应激情况,采用Western blot法检测大鼠脑缺血预适应模型中自噬相关蛋白、内质网应激相关蛋白及热休克蛋白HSP70的表达。结果:电镜观察显示,IPC 6 h和24 h皮层神经元胞浆内均有双层膜结构的自噬小体出现和内质网应激表现。PFI组6 h神经元内也有自噬小体和内质网应激表现,而在PFI组24 h,神经元出现为凋亡或坏死的形态特征。IPC+PFI组与PFI组相比较,神经元核膜比较完整,细胞器结构相对正常,在6 h和24 h胞浆内均出现自噬小体,内质网腔扩张,腔内出现灰白色聚集物。IPC+PFI可显著改善大鼠的神经行为学障碍,减小脑梗塞体积,减轻脑水肿(与PFI相比,P<0.01),提示缺血预适应可诱导神经保护作用。但3-MA(200和400 nmol),则显著加重缺血大鼠的行为学障碍,使脑梗塞体积增大,脑水肿严重(与溶剂+IPC+PFI组相比,P<0.01),提示自噬抑制剂取消了缺血预适应诱导的神经保护作用。Western blot结果显示,缺血后6 h,IPC,PFI,IPC+PFI以及溶剂+IPC+PFI组,LC3和Beclin 1的表达均上调(与假手术组相比,P<0.01),各组间无显著差异,但缺血24 h,仅IPC,IPC+PFI组LC3、Beclin 1表达上调(与假手术组相比,P<0.01),且IPC+PFI组较PFI LC3、Beclin 1上调组更为显著(P<0.01);3-MA不论在6 h还是24 h都明显抑制LC3、Beclin 1的表达(与溶剂+IPC+PFI组相比,P<0.01)。缺血24 h,IPC,PFI组HSP70均显著上调(与假手术组相比,P<0.01),IPC+PFI以及溶剂+IPC+PFI组HSP70表达则更加增强(与PFI组相比,P<0.01),但3-MA则明显抑制HSP70的表达(与溶剂+IPC+PFI组相比,P<0.01)。缺血后24 h,caspase-12在PFI组表达显著升高(与假手术组相比,P<0.01),但IPC+PFI组caspase-12表达下降(与PFI组相比,P<0.01),3-MA则增加caspase-12的表达(与溶剂+IPC+PFI组相比,P<0.01)。提示3-MA阻断缺血预适应的神经保护作用与抑制自噬有关。自噬诱导剂雷帕霉素(8、16和32 ng)在PFI 24 h前给药,与单纯缺血组相比较,能显著改善大鼠的神经行为学障碍,减小脑梗塞的面积,减轻脑水肿(与PFI组相比,P<0.01),提示预先激活自噬能产生对缺血的耐受。结论:1.脑缺血预适应能诱导自噬激活和内质网应激。2.自噬抑制剂3-MA能阻断脑缺血预适应诱导的神经保护作用,可能是通过抑制LC3、Beclin 1的表达,即通过抑制自噬-溶酶体途径实现的。3.缺血预适应能诱导适宜的ER应激,上调HSP70,下调caspase-12的表达,减轻致死性缺血时过度ER应激引起的细胞死亡。4.自噬诱导剂雷帕霉素在永久性脑缺血前预防给药能减小脑缺血面积,减轻脑水肿,对脑损伤有一定的保护作用。