论文部分内容阅读
目的:研究Epac-Rap1(exchange proteins directly activated by c AMP-Ras-related protein 1)信号通路在大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用,探讨药理学调控此信号途径是否为心肌缺血再灌注损伤的重要治疗分子靶点,并探明Epac-Rap1信号通路介导牡荆素抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制,为牡荆素应用于临床提供理论实验依据。方法:1.取SD(Sprague Dawley)雄性大鼠随机分为7组,分别为假手术组、缺血再灌注1 h组、缺血再灌注2 h组、缺血再灌注4 h组、缺血再灌注8 h组、缺血再灌注16 h组、缺血再灌注24 h组。采用6-0线结扎法,结扎大鼠左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注损伤(MIRI)模型。缺血1 h,再灌注1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h,并记录大鼠心肌缺血前、缺血1 h、再灌注结束时的心电图。HE染色观察大鼠左心室心肌组织的病理学变化;ELISA检测再灌注不同时间大鼠血清中c AMP的含量变化。Western Blot检测大鼠心肌组织中Epac1、Rap1、Ca MKⅡ和p-ERK的蛋白表达变化;免疫荧光检测大鼠心肌组织中Epac1、Rap1的表达;实时荧光定量PCR检测Epac1、Rap1的m RNA的表达变化。2.取SD雄性大鼠随机分为11组,分别为假手术组、MIRI模型组、8-CPT组、ESI-09组、6-BNZ组、H-89组、牡荆素+8-CPT组、牡荆素+ESI-09组、牡荆素组、牡荆素+6-BNZ组、牡荆素+H-89组。采用6-0线结扎法,结扎大鼠左冠状动脉前降支,缺血1h,再灌注4h,建立大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)模型。并记录实验过程中大鼠的心电图。HE染色观察大鼠左心室心肌组织的病理学变化;ELISA检测再灌注不同时间大鼠血清中c AMP的含量变化。Western Blot检测Epac1、Rap1、Ca MKⅡ和p-ERK的蛋白表达变化;免疫荧光检测心肌组织中Epac1、Rap1的表达;实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测Epac1、Rap1的m RNA的表达变化。结果:1.与假手术组相比,模型组(再灌1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h组)大鼠心肌缺血时ST段明显抬高,再灌注结束时ST段下降,但仍高于假手术组,并且随着再灌注时间延长,ST段降低的幅度越大。HE染色结果显示假手术组大鼠心肌组织染色均匀,排列整齐,显示正常的细胞结构架和心肌纤维。而模型组大鼠正常心肌结构不完整,排列紊乱,并有大量炎细胞浸润。再灌注4 h后,大鼠心肌可见有瘢痕组织,胶原纤维逐渐增多。ELISA结果显示,与假手术对照组比较,模型组大鼠血清中c AMP含量明显增加,随着大鼠心肌再灌注时间延长(1 h至24h),血清中c AMP的含量逐渐增高,呈时间依赖性。Western Blot结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Epac1、Rap1和Ca MKⅡ蛋白表达增加,同时ERK磷酸化增加,并且随着再灌注时间的延长(1h至24h),大鼠心肌组织中Epac1、Rap1和Ca MKⅡ蛋白表达逐渐增加,同时ERK磷酸化逐渐增多。免疫荧光结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Epac1和Rap1蛋白表达明显升高,从再灌1 h到24 h,Epac1和Rap1的表达量逐渐增加。Q-PCR结果显示,大鼠心肌组织中Epac1和Rap1的m RNA表达明显高于假手术组,随着再灌注时间的延长,其表达量逐渐增加,与心肌缺血再灌注时间呈正相关。2.与假手术组比较,在缺血1 h、再灌4 h时模型组的ST段都明显明显抬高,与模型组相比较,Epac激动剂(8-CPT)组可显著抬高ST段,Epac抑制剂(ESI-09)组、牡荆素(VT)组、ESI-09+牡荆素与H-89+牡荆素联合组可明显抑制大鼠ST段的抬高。HE染色结果显示,假手术组大鼠心肌组织染色均匀,排列整齐,未见明显异常改变,而MIRI模型组的大鼠正常心肌结构不完整,排列紊乱,并有大量炎细胞浸润,可见胶原纤维和瘢痕组织出现。与模型组比较,Epac激动剂可加重缺血心肌组织的损伤,Epac抑制剂、牡荆素(VT)组、ESI-09+牡荆素与H-89+牡荆素联合组均可显著减轻缺血心肌的损伤。ELISA结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠血清中c AMP的含量显著增加,Epac激动剂和PKA激动剂组大鼠血清中c AMP的含量较单纯模型组进一步增加,Epac抑制剂、PKA抑制剂和牡荆素均可降低大鼠血清中c AMP的水平。Western Blot结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Epac1、Rap1、Ca MKⅡ蛋白表达明显增加,同时其ERK磷酸化水平明显增加,Epac激动剂可上调大鼠心肌组织Epac1、Rap1、Ca MKⅡ蛋白表达和ERK磷酸化水平,Epac抑制剂与牡荆素及其联合用药组均可下调大鼠心肌组织中Epac1、Rap1、Ca MKⅡ蛋白表达以及增加ERK磷酸化水平,PKA激动剂可上调Ca MKⅡ蛋白表达,增加ERK磷酸化水平,PKA抑制剂可下调Ca MKⅡ蛋白表达并增加ERK磷酸化,对Epac1和Rap1蛋白表达无明显影响。免疫荧光结果显示,模型组大鼠Epac1、Rap1蛋白在心肌组织中的表达水平明显高于假手术组,Epac激动剂可增加Epac1、Rap1蛋白在心肌组织表达,Epac抑制剂和牡荆素均可抑制Epac1、Rap1蛋白在心肌组织表达,PKA激动剂和抑制剂对Epac1和Rap1蛋白在心肌组织表达无明显影响。PCR结果显示,模型组的Epac1、Rap1的m RNA表达明显高于假手术组,Epac激动剂可上调Epac1、Rap1的m RNA表达,Epac抑制剂和牡荆素下调Epac1、Rap1的m RNA表达,PKA激动剂和抑制剂对Epac1和Rap1的m RNA含量表达无明显影响。结论:研究结果显示,大鼠MIRI后,心肌组织中c AMP水平升高,心肌细胞内信号分子Epac1激活,表达上调,并导致其下游的Rap1激活,促进心肌损伤;Epac1激动剂(8-CPT)可进一步促进心肌细胞Epac1过表达和下游Rap1激活,加重心肌损伤;Epac1抑制剂(ESI-09)可抑制MIRI心肌细胞Epac1的激活,抑制其过表达和下游Rap1激活,并抑制Epac1m RNA及Rap1m RNA基因表达,同时抑制其下游Ca MKⅡ蛋白的表达和ERK的磷酸化,减轻心肌病理性损伤;牡荆素(3mg/kg)可显著抑制MIRI大鼠心肌组织损伤,抑制MIRI大鼠心肌细胞Epac1的激活,并抑制其过表达和下游Rap1活化,同时抑制其下游Ca MKⅡ蛋白的表达和ERK的磷酸化,以及抑制Epac1m RNA及Rap1m RNA基因表达,Epac1抑制剂(ESI-09)与牡荆素具有协同作用。上述结果提示Epac-Rap1信号通路在心肌缺血再灌注损伤机制中发挥重要作用,牡荆素可通过调控Epac-Rap1信号通路发挥抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。