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第一部分FGF21及其相关受体在胰腺组织中的表达分布研究目的:研究FGF21及其相关受体FGFR1和KLB在胰腺组织中的表达分布规律,并探索FGF21在正常胰腺与胰腺癌中的表达情况。方法:通过qRT-PCR、Western Blot以及免疫组织化学染色方法检测对比正常70天龄小鼠的胰腺组织和肝脏组织的FGF21表达情况;通过qRT-PCR和半定量PCR检测正常70天龄小鼠的胰腺组织和肝脏组织的FGFR1表达情况;通过qRT-PCR、Western Blot以及免疫组织化学染色方法检测对比正常70天龄小鼠的胰腺组织和肝脏组织的KLB表达情况;通3过qRT-PCR检测7月龄老年小鼠的胰腺和肝脏组织中FGF21、FGFR1和KLB三种基因的表达情况;通过免疫组织化学染色明确成人胰腺癌组织与正常胰腺组织的FGF21表达差异,再通过qRT-PCR比较正常胰腺细胞和含有Kras突变的人胰腺癌细胞系中FGF21的表达差异。结果:qRT-PCR、Western Blot以及免疫组织化学染色（IHC）结果均显示正常70天龄小鼠胰腺组织中存在FGF21表达并且表达量显著高于肝脏组织（p<0.05）,其中qRT-PCR显示胰腺组织中FGF21的表达量是肝脏组织的约80倍。免疫组织化学染色确认了FGF21在胰腺中高表达。Western blot结果发现胰腺中FGF21蛋白水平高于肝脏。半定量PCR检测FGFR1的结果显示正常70天龄小鼠胰腺组织中FGFR1的表达明显高于肝脏组织中的FGFR1表达量,而qRT-PCR结果显示FGFR1基因在胰腺组织中表达量是肝脏组织的约12倍（p<0.05）。Western Blot结果显示KLB在正常70天龄小鼠胰腺组织表达,通过qRT-PCR方法与肝脏组织比较后发现KLB在肝脏和胰腺组织表达量未见明显差异（p>0.05）,而免疫组织化学染色结果直观的证实了KLB在胰腺组织中表达,并且主要存在与腺泡而非胰岛细胞。通过qRT-PCR检测7月龄老年小鼠的胰腺和肝脏组织中FGF21、FGFR1和KLB三种基因的表达的结果显示FGF21在胰腺组织中的表达量显著高于肝脏组织（p<0.05）,约是在肝脏组织中的60倍;FGFR1在胰腺组织中的表达量显著高于肝脏组织（p<0.05）,约是在肝脏组织中的12倍;KLB在胰腺组织和肝脏组织中表达量未见明显差异（p>0.05）。为检测FGF21在胰腺癌中的表达水平,我们对人胰腺组织芯片进行了免疫组织化学染色,比较胰腺导管腺癌和正常胰腺组织中FGF21的水平。通过对正常人胰腺组织45份和胰腺导管腺癌组织59份标本进行FGF21免疫组织化学染色并评分结果显示FGF21在胰腺癌组织中表达量显著降低（p<0.05）,通过qRT-PCR比较正常胰腺细胞与多种胰腺癌细胞中FGF21表达结果证实胰腺癌细胞中FGF21基因表达与正常胰腺细胞相比显著降低（p<0.05）。结论:FGF21及其受体FGFR1以及共受体KLB在正常胰腺组织中均有表达,且FGF21以及FGFR1在胰腺组织中的表达量显著高于肝脏组织中的表达。且KLB主要分布与胰腺腺泡细胞而非胰岛细胞,以上结果提示FGF21在小鼠胰腺组织中主要在其外分泌过程中发挥作用。另外通过对老年小鼠的研究结果显示结果与成年小鼠结果一致提示年龄因素对FGF21及其受体影响不大。胰腺癌组织和细胞的研究结果表明FGF21在正常胰腺组织和胰腺癌组织明显差异性表达,FGF21在胰腺癌中程显著低表达。第二部分KrasG12D/+介导胰腺FGF21低表达的机制研究目的:明确KrasG12D基因突变小鼠FGF21低表达的可能机制。方法:通过qRT-PCR以及FGF21免疫组织化学染色比较FGF21在正常胰腺组织和KrasG12D/+小鼠胰腺组织中的表达情况,再通过qRT-PCR研究KrasG12D突变早期FGF21、FGFR1和KLB的变化情况;通过qRT-PCR研究MIST1在KrasG12D+诱导表达后1周、1月、5月时的胰腺组织中表达情况。然后通过qRT-PCR研究KrasG12D/+小鼠与正常小鼠EZH2的表达情况,并且通过沉默KrasG12D+小鼠的EZH2基因采用qRT-PCR明确FGF21、MIST1的表达与EZH2表达的相关性;再使用EZH2抑制剂（DZNep）处理PANC1胰腺癌细胞后通过qRT-PCR以及半定量PCR研究EZH2抑制后胰腺癌细胞中FGF21的表达变化。最终明确KrasG12D/+、MIST1、EZH2等参与胰腺癌组织中FGF21低表达过程中的重要机制作用。结果:首先是qRT-PCR提示FGF21在KrasG12D+诱导表达5月后的小鼠胰腺组织中显著低表达,而FGF21的免疫组织化学染色结果证实了这一结果,也显示Kras G12D基因突变后FGF21表达显著降低;KrasG12D+表达早期（一周）时的qRT-PCR分析结果显示FGF21在突变早期表达就显著降低,而FGFR1与KLB则未见明显变化。而对KrasG12D+诱导表达后不同时间段MIST1的基因表达研究表明MIST1也在突变早期表达就显著降低,并且随着KrasG12D表达时间的增加,MIST1的表达也逐渐降低,直到KrasG12D+诱导表达5月后小鼠胰腺组织中MIST1的表达几乎消失,随后Western Blot也证实KrasG12D表达后MIST1蛋白表达量降低。对EZH2的qRT-PCR研究结果显示其在KrasG12D突变小鼠胰腺组织中的表达结果显著高于正常对照。而再次比较正常小鼠、KR-EZH2(KrasG12D/+小鼠沉默EZH2基因)、KrasG12D/+小鼠三组胰腺组织中FGF21以及MIST1的表达结果显示KR-EZH2组中FGF21以及MIST1的表达量虽显著低于正常对照组,但却显著高于KrasG12D/+组。而DZNep处理PANC1胰腺细胞后细胞中FGF21基因表达量显著升高,半定量PCR也显示FGF21的表达水平与DZNep加入的浓度成正相关。结论:Kras G12D基因突变可早期显著降低FGF21在胰腺组织中的表达,同时早期降低的还有FGF21的上游基因MIST1,其在KrasG12D基因突变后变化趋势与FGF21一致,表明KrasG12D突变后通过MIST1下调FGF21水平。而EZH2在KrasG12D/+小鼠胰腺组织中高表达,且在KrasG12D/+小鼠中沉默EZH2后胰腺中的FGF21与MIST1的表达量明显回升,表明EZH2是KrasG12D突变导致FGF21降低的关键;而通过EZH2抑制剂（DZNep）处理胰腺癌细胞导致FGF21高表达的结果再次验证了EZH2也是胰腺癌中FGF21低表达的关键因子;因此综上表明胰腺癌中FGF21的显著低表达是KrasG12D位点突变导致EZH2表达显著升高、MIST1表达显著降低最终导致FGF21的表达降低。第三部分外源性FGF21治疗对KrasG12D/+小鼠在高脂饮食诱导下胰腺癌的发生疗效的动物实验研究目的:通过动物实验验证外源性补充FGF21治疗KrasG12D/+小鼠高脂饮食诱导胰腺癌易感性的疗效,验证KrasG12D/+小鼠在高脂饮食诱发下胰腺癌的高发的原因是由于FGF21降低造成的,最终明确外源性补充FGF21能够抑制KrasG12D突变情况下高脂饮食诱导的胰腺癌发生。方法:首先设立四个小组:Bac小鼠+ND（正常饮食）正常对照组,KrasG12D/+小鼠+ND（正常饮食）组,KrasG12D/+小鼠+HFD（高脂饮食）组,KrasG12D/+小鼠+HFD（高脂饮食）+rh FGF21组。每组取10周大的小鼠8只,在他莫昔芬诱导KrasG12D表达后一周,开始给予不同饮食和FGF21处理。在小鼠5月龄大时处死,取各组小鼠胰腺标本进行制备病理切片H&E染色观察统计胰腺癌变发生率,并检测小鼠胰腺组织中TG、α-SMA和Amylase的表达情况,再通过Sirius Red染色、CK19、Cox-2、F4/80、CD3、Cyclin D1、Ki-67等免疫组织化学染色观察各组小鼠胰腺组织具体结构变化、炎性改变、免疫细胞浸润、细胞增殖等现象,并进行对比。另外再设立继续按照4种分组随访,记录各组小鼠的食物摄入情况以及体重变化情况,绘制变化曲线,各组间进行比较。以各组小鼠死亡为观察终点,绘制各组小鼠生存曲线。结果:在5月龄处死组中,HFD+KrasG12D/+小鼠组胰腺组织显著肥大异常,而rh FGF21+HFD+KrasG12D/+小鼠组,和ND饲养组大体观均未见显著异常。H&E结果显示HFD+KrasG12D/+小鼠组中5/8的小鼠病理发现诊断PDAC,而rh FGF21+HFD+KrasG12D/+小鼠组为1/8,另外两组ND饲养组均未见恶变病例。另发现TG、α-SMA在HFD+KrasG12D/+小鼠组显著升高,Amylase在HFD+KrasG12D/+小鼠组表达量显著降低。Sirius Red染色、CK19、Cox-2、F4/80、CD3、Cyclin D1、Ki-67等免疫组织化学染色结果显示HFD+KrasG12D/+小鼠组胰腺组织阳性染色显著增加。另外随访结果显示KrasG12D/+小鼠+HFD（高脂饮食）组和KrasG12D/+小鼠+HFD（高脂饮食）+rh FGF21摄入食物量少于BAC小鼠+ND（正常饮食）正常对照组,KrasG12D/+小鼠+ND（正常饮食）组,KrasG12D/+小鼠+HFD（高脂饮食）组和KrasG12D/+小鼠+HFD（高脂饮食）+rh FGF21食物摄取量没有差异。每组雄性小鼠食物摄取量大于较雌性小鼠。长期随访结果显示外源性FGF21治疗可推迟KrasG12D/+小鼠在高脂饮食情况下胰腺癌的发生时间,显著延长高脂饮食下作用下的KrasG12D/+小鼠生存时间。结论:综上我们通过体内实验明确外源性FGF21治疗可显著减少KrasG12D/+小鼠高脂饮食诱导下胰腺组织炎性反应,免疫细胞浸润、结构异常等,并最终减少胰腺组织癌变的发生,大大提高KrasG12D/+小鼠在高脂饮食条诱导下的生存时间。通过以上结果最终明确KrasG12D突变所致的胰腺FGF21的低表达是导致胰腺癌在高脂饮食诱导下高发的关键因素。因此也证明FGF21有潜力成为预防治疗KrasG12D基因突变相关胰腺癌发生的特效药物。