论文部分内容阅读
猪等孢球虫是猪场防治的主要寄生虫之一,对仔猪的致病性较强,常导致仔猪腹泻和体重降低。成年猪常呈隐性感染或携带者,可对仔猪健康造成潜在威胁,患病仔猪可继发其他肠道疾病,对发病猪场造成重大经济损失。贾第虫是另一种重要的肠道寄生虫,具有人兽共患性。其感染猪病例已被很多国家报道,表明贾第虫病猪可作为十二指肠贾第虫感染人的传播来源。对猪场进行贾第虫和猪等孢球虫感染的调查,在防控猪的两虫病上有重要意义。目前,对这两种寄生虫的检查常用的是显微镜形态学检测和单病原PCR检测。传统的显微镜检测方法对操作者技术水平和经验有较高要求,且阳性检出率不高;而PCR检测法虽然灵敏度高但同时检测多个病原时,却需对一份样品多个虫种不同基因位点分别扩增和检测,耗时费力。故寻找一种能同时检测出两种虫的灵敏度高的双重PCR检测方法,可有效地提高检测效率。因此,本研究分别针对贾第虫GDH基因和猪等孢球虫SSU rRNA基因,建立并优化了一套灵敏度高、特异性强的双重巢式PCR方法,并使用该方法对我国河南省部分地区猪场的猪等孢球虫和贾第虫感染情况进行了流行病学调查,为了解猪等孢球虫和贾第虫在猪场中的流行情况提供了理论依据。隐孢子虫是另一种重要的人兽共患性原虫,主要引起肠胃炎和急慢性腹泻,世界各地广泛流行。现有的隐孢子虫基因分型和亚型分型工具已将隐孢子虫分为36个种,70多个基因型,但仍有其局限性。对于和人隐孢子虫（C.hominis）SSU rRNA基因相似的兔隐孢子虫（C.cuniculus）、horse genotype、donkey genotype、来自袋鼠的与C.hominis完全相似的隐孢子虫,及其人和不同动物来源的C.parvum之间的区分依靠现有的分型工具,仍难以区分出动物来源和不同虫株间的差异。而Lectin基因作为分型工具时发现不同隐孢子虫种类在该位点的序列不同,尤其是不同种隐孢子虫有数量不等的CAA三联密码子重复序列。根据其他原虫相关研究,如溶组织阿米巴凝集素蛋白对阿米巴致病力的影响,推测该基因编码的蛋白可影响隐孢子虫的入侵、繁殖和致病力。因此,该基因位点极有可能成为人兽共患隐孢子虫的分类和遗传研究的有效得力的工具。1猪等孢球虫和贾第虫双重巢式PCR检测方法的建立和应用为同步检测引起猪腹泻的猪等孢球虫和贾第虫这两种重要的肠道寄生虫,本研究分别针对猪等孢球虫SSU rRNA基因和贾第虫GDH基因建立并优化了一套双重巢式PCR方法。结果显示:双重巢式PCR对GDH和SSU rRNA扩增的产物大小分别为432bp和530bp。该双重巢式PCR对贾第虫和猪等孢球虫的敏感性分别为5.51pg·μL-1和385fg·μL-1,表明该双重巢式PCR的敏感性较高。临床检测:用优化好的双重巢式PCR对53份临床样品进行检测,结果显示:双重巢式PCR扩增猪等孢球虫阳性率为20.7%（11/53）,贾第虫阳性率为5.7%（3/53）,混合感染阳性率为3.8%（2/53）;单病原PCR检测与双重巢式PCR检测结果相差不大,无统计学意义（P>0.05）。该双重巢式PCR方法可以用来对猪十二指肠贾第虫和猪等孢球虫进行快速准确地检测。2河南省部分地区猪等孢球虫和贾第虫的分子流行病学调查为了解河南省部分地区猪等孢球虫和贾第虫的分子流行情况,共采集212份猪粪便样品,分别采用单巢式PCR方法和本试验所建立的双重巢式PCR方法特异性扩增猪等孢球虫SSU rRNA基因和贾第虫GDH基因片段。结果显示,猪等孢球虫和贾第虫的总体阳性率为25.9%（55/212）,猪等孢球虫的总感染率为20.3%（43/212）,贾第虫的总感染率为5.7%（12/212）,两种虫的混合感染率为2.8%（6/212）。所有场都至少感染一种虫种。仔猪阶段猪等孢球虫和贾第虫的感染率最高35.8%（39/109）,育肥猪阶段最低3.4%（1/29）,表明不同年龄段间猪等孢球虫和贾第虫感染情况差异较大;正阳县某猪场猪等孢球虫和贾第虫的总阳性率最高为45.5%（5/11）,许昌市某猪场的阳性率最低为17.9%（7/39）,表明不同地区猪等孢球虫和贾第虫的感染差异较大。以上结果表明,猪等孢球虫和十二指肠贾第虫在我国猪场中猪的感染率较高,分布较为广泛,需进行更深入的流行病学调查,以期为猪等孢球虫病和贾第虫病的防控提供合理的实验依据。3隐孢子虫基于Lectin基因PCR鉴定方法的建立为了解隐孢子虫凝集素基因在不同分离株的序列差异及其遗传进化关系,以SSU rRNA基因作参照,评价Lectin基因位点作为隐孢子虫基因分型和进化关系分析的可行性。对实验室分离保存的多份隐孢子虫分离株分别在Lectin和SSU rRNA位点处采用巢式PCR方法进行扩增。并用ClustalX对扩增序列与参考序列进行比对,用MEGA5中的邻近法（Neighborjoiningmethod NJ）,进行进化树的构建。结果显示:基于Lectin基因位点,在C.parvum,C.hominis,C.cuniculus及其在SSU rRNA处与人源C.hominis极为相近的horsegenotype,驴源C.hominis均成功扩增出了大小在450bp左右的目的条带,并进行了进化树的分析,不同种类和同种不同动物来源的隐孢子虫分布在不同的分支上。结论:Lectin基因位点可很好地区分SSU rRNA序列极为相似的几种隐孢子虫,有望为人兽共患隐孢子虫分类和遗传研究提供新的基因靶标。