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研究背景世界范围内,肺癌是致死率最高的癌症之一。肺癌可分为两种:小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。其中,NSCLC约占肺癌的85%,是最常见的恶性肿瘤。近年来有文献报道,蛋白质翻译后修饰异常与肺癌发生发展过程密切相关,其中包括糖基化修饰。蛋白质的糖基化修饰是一种常见的翻译后修饰,一般于内质网中开始,于高尔基体中结束,指在糖基转移酶的作用下,糖和蛋白质上的氨基酸残基共价结合形成糖苷键的过程。蛋白质糖基化可分为四种类型:O-糖基化、N-糖基化、糖基化磷酸脂酰肌醇、C-糖蛋白。人体内超过50%的蛋白质存在糖基化修饰。这些糖蛋白在细胞膜和体液中广泛分布,绝大部分膜蛋白和分泌蛋白都存在糖基化修饰。文献报道,肺癌等恶性肿瘤中异常的糖基化修饰参与肿瘤的发生发展,不良预后等过程。例如近年来发现,肿瘤细胞表面CD147等蛋白的N-糖基化修饰异常,与肿瘤细胞的侵袭迁移等过程密切相关。综上所述,深入研究肿瘤细胞膜蛋白N-糖基化修饰及其调控机制,将有助于阐明NSCLC发生发展的分子机制,为其诊断提供新候选靶点,为其临床诊断提供新思路。T细胞免疫球蛋白域与黏蛋白域4(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 4,TIM-4)属于TIM基因家族,是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白。TIM-4蛋白的分子结构包括含有含有磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)结合位点的IgV区、包含N-糖基化位点和O-糖基化位点的mucin区、跨膜区和胞内区。TIM-4蛋白高表达于抗原提呈细胞表面,尤其是成熟树突状细胞和居留巨噬细胞表面。文献报道,除免疫细胞外,TIM-4在多种不同类型的恶性肿瘤中也有表达,恶性肿瘤中异常表达的TIM-4与肿瘤的发生发展密切相关。实验室前期结果显示,TIM-4在NSCLC组织中的表达高于癌旁,且TIM-4的表达水平与其预后呈负相关,另外,TIM-4可促进IL-6介导的NSCLC迁移侵袭。然而,基于TIM-4N-糖基化修饰的研究,特别是TIM-4N-糖基化修饰在肿瘤发生发展中的作用尚不清楚。本研究从N-糖基化修饰的角度,阐述了 TIM-4分子在NSCLC侵袭迁移中的作用及机制,为基于靶向TIM-4分子的肿瘤诊断和治疗提供了新的线索。研究目的本课题以非小细胞肺癌为研究对象,探讨了 N-糖基化修饰在TIM-4介导NSCLC侵袭迁移中的关键作用及其分子机制,为NSCLC的治疗提供新的思路。目的如下:1.鉴定NSCLC中TIM-4蛋白N-糖基化修饰的位点2.明确N-糖基化修饰对TIM-4介导NSCLC细胞侵袭迁移的影响3.探明N-糖基化修饰对TIM-4蛋白生物学特性的影响研究方法与结果1.NSCLC中TIM-4蛋白N-糖基化修饰位点的鉴定1.1 TIM-4存在N-糖基化修饰为了明确TIM-4是否存在N-糖基化修饰,将TIM-4野生型质粒转染至肺癌细胞系中,加入衣霉素(tunicamycin,TM)处理,收集细胞,提取蛋白,并利用蛋白质印记(western blot,WB)技术检测TM处理前后TIM-4分子量的变化情况;另外,将TIM-4野生型质粒转染至肺癌细胞系,收集细胞,提取蛋白,再分别用PNGaseF酶、EndoH酶处理蛋白,WB技术检测酶切处理前后TIM-4蛋白分子量变化情况。结果显示,TM处理及酶切后,TIM-4蛋白的分子量皆有不同程度的下调。以上结果提示,NSCLC中TIM-4存在N-糖基化修饰。1.2 TIM-4蛋白N-糖基化位点的预测为了明确TIM-4潜在的N-糖基化修饰位点,通过网站(NetNGlyc 1.0 Server)进行预测,将TIM-4蛋白的序列输入后,根据N-糖基化修饰的氨基酸序列(N-X-S/T,X!=P)进行预测。结果显示,TIM-4蛋白序列中N101位点存在N-糖基化修饰的几率为67%、N291位点存在N-糖基化修饰的几率为41%。1.3 TIM-4蛋白N-糖基化位点的鉴定根据上述结果,分别设计、构建了 TIM-4 N-糖基化位点单独或联合突变质粒,经测序鉴定载体构建成功,分别命名为N101Q、N291Q、N101/291Q。将TIM-4野生型以及突变质粒分别转染至肺癌细胞系,利用WB技术检测N-糖基化位点突变前后TIM-4分子量的变化情况。结果显示,相较于野生型TIM-4质粒转染组的蛋白条带,N101Q质粒转染组的蛋白分子量无明显变化,而N291Q质粒转染组的蛋白分子量有一定程度的下降,双位点联合突变(N101/291Q)质粒转染组的蛋白分子量下降程度与N291Q相同,说明第101位可能不存在N-糖基化修饰,而第291位确实存在N-糖基化修饰。综上,成功构建了 TIM-4的N-糖基化位点突变体质粒,用于进行后续的实验。2.N-糖基化修饰对TIM-4介导NSCLC细胞侵袭迁移的影响2.1 N-糖基化修饰促进TIM-4介导凋亡细胞吞噬为了探究N-糖基化修饰是否影响TIM-4介导的凋亡细胞吞噬功能,利用NIH3T3细胞构建了吞噬凋亡细胞的体系,荧光显微镜观察吞噬凋亡细胞的数目。结果显示,相比野生型TIM-4组,转染N291Q的NIH3T3细胞吞噬凋亡细胞的数目减少,说明去除N-糖基化修饰后,TIM-4介导的凋亡细胞吞噬功能被抑制。上述结果提示,N-糖基化修饰可能会影响TIM-4的生物学功能。2.2 N-糖基化修饰促进TIM-4介导NSCLC细胞的EMT为了进一步明确N-糖基化修饰对TIM-4功能的影响,探讨了 N-糖基化修饰对 TIM-4 促进 NSCLC 细胞上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)作用的影响。分别将对照空载体pcDNA3及TIM-4、N291Q转染至肺癌细胞系中,收集细胞,提取RNA及蛋白,分别利用qPCR及WB检测TIM-4及EMT相关分子标志物(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)的表达。结果显示,相比TIM-4组,N291Q组E-cadherin表达量有一定程度的上调,而N-cadherin和Vimentin表达量则有所下调。以上结果说明,N-糖基化修饰可促进TIM-4介导NSCLC 的 EMT。2.3 N-糖基化修饰增强TIM-4促进NSCLC细胞的侵袭迁移EMT在肿瘤的侵袭迁移过程中扮演重要作用,N-糖基化修饰可增强TIM-4促进肺癌细胞的EMT,为了探讨N-糖基化修饰是否会进一步影响TIM-4对肺癌细胞侵袭迁移的促进作用,将对照空载体pcDNA3及TIM-4、N291Q转染至肺癌细胞系中,转染后24h,通过划痕愈合实验、transwell实验检测肺癌细胞侵袭迁移的变化。结果显示,与TIM-4组相比,N291Q组的肺癌细胞侵袭迁移细胞数显著降低,上述结果表明,N-糖基化修饰可促进TIM-4介导NSCLC的侵袭迁移。3.N-糖基化修饰对TIM-4蛋白生物学特性的影响3.1 N-糖基化位点突变导致TIM-4蛋白稳定性降低文献报道,N-糖基化修饰可能会影响蛋白质的稳定性。为了明确N-糖基化修饰是否通过影响TIM-4的稳定性,进而影响TIM-4对NSCLC侵袭迁移的促进作用,将TIM-4质粒转染至HEK293细胞中,加入TM处理,同时使用放线菌酮(cycloheximide,CHX)处理,收集细胞,提取蛋白,利用WB技术检测TIM-4分子表达量的变化。结果显示,相比DMSO对照组,TM组TIM-4蛋白稳定性降低,降解速度加快。另外,将TIM-4及N291Q质粒分别转染至HEK293细胞中,加入CHX处理,收集细胞,提取蛋白,利用WB技术检测TIM-4分子表达量的变化。结果显示,相比TIM-4组,N291Q组TIM-4蛋白半衰期变短,降解速度加快。上述结果提示,去除N-糖基化修饰后,TIM-4蛋白稳定性降低,降解速率加快。为了研究N-糖基化位点突变后,TIM-4通过哪种途径进行降解,将TIM-4及N291Q质粒分别转染至肺癌细胞系中,再利用蛋白酶体抑制剂N-苄氧基羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酸(Z-Leu-Leu-Leu-CHO,MG132)或溶酶体途径抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)分别处理细胞。结果显示,用MG132处理细胞后,相比TIM-4组,N291Q组TIM-4表达量有明显积累,而用CQ处理细胞后,相比TIM-4组,N291Q组TIM-4表达量无明显变化。上述结果提示,N-糖基化位点突变后,TIM-4主要通过蛋白酶体途径进行降解。接下来,利用免疫共沉淀检测了 N-糖基化位点突变以及TM处理前后TIM-4泛素化修饰情况的变化。将泛素分子表达载体分别与pcDNA3、TIM-4、N291Q质粒共转染至肺癌细胞,MG132处理4h,提取蛋白,用HA抗体沉淀收集的蛋白裂解液,WB技术检测沉淀下来的复合物中泛素分子和TIM-4蛋白的水平。结果显示,相比TIM-4组,N291Q组多聚泛素化的TIM-4蛋白梯度条带明显增强。上述结果提示,去除N-糖基化修饰后,TIM-4可被细胞中泛素-蛋白酶系统识别并发生多聚泛素化,随即通过泛素-蛋白酶体途径进行降解。3.2 N-糖基化位点突变导致TIM-4分子定位改变文献报道,N-糖基化修饰可能会影响蛋白质的分子定位。为了明确N-糖基化修饰是否通过影响TIM-4分子的定位,进而影响TIM-4对NSCLC侵袭迁移的促进作用,将TIM-4及N291Q质粒分别转染至肺癌细胞系,利用激光共聚焦检测TIM-4蛋白在肺癌细胞系中的定位。结果显示,去除N-糖基化修饰后,TIM-4蛋白分子定位明显变化,野生型TIM-4主要表达于细胞膜,而N-糖基化位点突变的TIM-4滞留于细胞质中。文献报道,当蛋白的N-糖基化修饰发生变化时,蛋白质会被内质网视为一种错误折叠蛋白,进而滞留在内质网中,与内质网共定位。为了探究TIM-4中N-糖基化位点突变后是否存在这一现象,将TIM-4、N291Q质粒与pmCherry-Sec61b-C1质粒(ER-marker)共转染至肺癌细胞系中,利用激光共聚焦法检测TIM-4蛋白与内质网的共定位。结果显示,相比TIM-4组,N291Q组TIM-4分子定位发生改变,且与内质网有明显的共定位。3.3 N-糖基化位点突变导致TIM-4经ERAD途径降解上述结果显示,去除N-糖基化修饰后,TIM-4通过泛素-蛋白酶体途径进行降解,且与内质网存在共定位。文献报道,蛋白质修饰折叠错误后,可通过ERAD途径进行降解。为了探究N-糖基化位点突变后的TIM-4是否通过ERAD途径进行降解,将TIM-4及N291Q质粒转染至肺癌细胞系,利用ERAD途径抑制剂EeyarestatinI(EerⅠ)处理细胞,再利用WB技术检测TIM-4分子表达量的变化。结果显示,EerⅠ处理后,相比TIM-4组,N291Q组TIM-4表达量明显积累。上述结果表明,去除N-糖基化修饰后,TIM-4蛋白可通过ERAD途径降解。研究结论TIM-4存在N-糖基化修饰,且N-糖基化修饰发生在TIM-4第291位。当N-糖基化位点突变后,TIM-4稳定性降低,且与内质网发生共定位,并通过ERAD途径进行降解,使得细胞膜上TIM-4表达量降低,从而抑制了 TIM-4对NSCLC细胞EMT及侵袭迁移的促进作用。创新性及研究意义本文证实TIM-4存在291位N-糖基化修饰,确定了 291位N-糖基化修饰可影响TIM-4生物学功能,并从N-糖基化修饰的角度阐述了 TIM-4分子促进NSCLC侵袭迁移的机制,为以TIM-4为靶点的肿瘤诊断和治疗提供思路和线索。