论文部分内容阅读
[目的]探究广叶绣球菌多糖（Sparassis latifolia polysaccharides,SLPs）对免疫低下小鼠肠道微生态环境的影响,并进一步探究G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors,GPCRs）介导的免疫调节机制。[方法]（1）将60只6周龄SPF级昆明系雄性小鼠,适应环境一周后,随机分成正常对照组（NC）、模型组（CY）、广叶绣球菌多糖低剂量组（CY+LD）、中剂量组（CY+MD）、高剂量组（CY+HD）和阳性对照组（CY+LH）。除NC组组外,其余组小鼠连续3 d腹腔注射80 mg/kg·d的环磷酰胺（Cyclophosphamide,CY）,构建免疫低下小鼠模型,NC组腹腔注射等量生理盐水。造模成功后阳性对照组组小鼠灌胃10mg/kg·d的盐酸左旋咪唑（Levamisole hydrochloride LH）;广叶绣球菌多糖低、中、高三组分别灌服100mg/kg·d、200 mg/kg·0d和400 mg/kg·d的多糖溶液;其余两组小鼠灌服等体积蒸馏水。试验期间每天观察小鼠状态、记录体质量变化。饲养30 d后,空腹24 h,称重脱颈处死,在无菌条件下分别迅速取出脾脏和胸腺清洗干净并称重,计算脾脏指数、胸腺指数;采集小鼠空肠组织,HE染色观察肠道组织结构,计算绒毛长度/隐窝深度的比值（V/C值）;采集小鼠小肠组织,酶联免疫吸附法测定小鼠小肠组织细胞因子白细胞介素-6（interlrukin,IL-6）、IL-10、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）和分泌型免疫球蛋白（Immunoglobulin A s Ig A）的含量。（2）采集盲肠内容物,高通量测序技术（High-throughput sequencing）分析小鼠肠道菌群的变化,气-质联用（GC-MS）分析盲肠内容物短链脂肪酸（short chain fatty acids,SCFAs）的含量;采集小鼠小肠组织,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）测定G蛋白偶联受体GPR41、GPR43和GPR109A,及下游关键因子FOXP-3、IL-6、IL-8和L-10的mRNA相对表达量;采用蛋白免疫印迹技术（Western blot）分析G蛋白偶联受体GPR41、GPR43和GPR109A的蛋白表达量。[结果]（1）在实验造模期间,腹腔注射环磷酰胺后的小鼠摄食量降低,体重下降,毛色发暗且尾根部有脱毛现象。与正常对照组比较,模型组小鼠脾脏指数与胸腺指数降低、小肠绒毛长度和小鼠V/C值降低、小肠组织中4种细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和INF-γ质量浓度以及s Ig A分泌水平均降低,差异均显著或极显著（P＜0.01或P＜0.05）。与模型组比较,多糖高剂量组中小鼠脾脏指数与胸腺指数升高、小肠绒毛长度和V/C值增加、细胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和INF-γ质量浓度以及s Ig A分泌水平增加,差异均显著或极显著（P＜0.05或P＜0.01）。（2）与正常对照组比较,模型组Shannon指数显著降低（P＜0.01）;与模型组比较,多糖组Shannon指数呈剂量依赖性增加,其中高剂量组Shannon指数增加显著（P＜0.05）。在OUT水平上,通过主成分分析,多糖剂量组中随多糖浓度的升高与模型组重合度降低,与阳性对照组重合度升高;在门水平上,实验各组小鼠肠道菌群组成平均84.15%以上都是由厚壁菌门Firmicutes和拟杆菌门Bacteroidetes组成,其中厚壁菌门Firmicutes和拟杆菌门Bacteroidetes在高剂量组中占比例为最低和最高,分别为56.25%、32.64%;在属水平上,Bacteroides、Alloprevotella、Butyrivibrio、Intestinimonas、Streptococcus随着多糖浓度的增加而增加,其中高剂量组差异显著或极显著（P＜0.05或P＜0.01）。与正常对照组比较,模型组各SCFAs含量均下降,其中乙酸、丙酸下降显著（P＜0.05或P＜0.01）;肠组织中GPR41、GPR43、GPR109A、FOXP-3、IL-6、IL-8和L-10的mRNA表达量和G蛋白偶联受体GPR41、GPR43、GPR109A的蛋白表达量均下降,差异显著或极显著（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较,剂量组中各SCFAs含量均增加,其中中、高剂量组差异显著或极显著（P＜0.05或P＜0.01）;高剂量组中GPR41、GPR43、GPR109A、FOXP-3、IL-6、IL-8、IL-10的mRNA的表达量和GPR41、GPR43、GPR109A的蛋白表达量均升高,差异均极显著（P＜0.01）。[结论]广叶绣球菌多糖通过改善肠道粘膜形态结构,提高小肠细胞因子水平,调节肠道菌群结构,增加SCFAs产生菌的相对丰度,提高SCFAs含量,诱导G蛋白偶联受体GPR41、GPR43、GPR109A的表达,从而介导上调FOXP-3、IL-6、IL-8和L-10的表达,参与调节免疫低下小鼠的肠道免疫功能,发挥抗炎作用,调节肠道微生态环境,促进健康。