论文部分内容阅读
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种高度接触性急性肠道传染病,发病急、传播速度快,仔猪致死率高,给我国养猪业带来巨大的经济损失。由于目前流行的PEDV毒株与现有疫苗毒株差异较大,导致现有的疫苗免疫保护率不高,因此,开发抗PEDV疫苗及生物制剂具有重大的现实意义。本研究根据Genbank上PEDV S基因序列(登录号JN601050.1)设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从患PED仔猪肠组织中扩增出约520 bp的基因片段,构建了重组表达质粒pET-32a-S1,转化至感受态细胞BL21(DE3)中,经0.4mmoL/L IPTG诱导表达6 h后成功表达出约33 kDa大小的可溶性重组蛋白。该重组蛋白经镍NTA琼脂糖凝胶纯化后,利用核酸蛋白仪测得浓度为3.2 mg/mL,Western Blot检测结果显示特异性良好。以稀释后的重组蛋白作为抗原包被酶标板,以鸡血清为待检样本、酶标兔抗鸡IgY为第二抗体,建立了一种特异性和敏感性高、重复性和稳定性好的间接ELISA检测鸡血清、卵黄抗PEDV抗体的方法。同时将50只初产蛋鸡分为组织灭活苗组、病毒灭活苗组、S蛋白疫苗组、综合免疫组以及对照组五组进行免疫试验,并利用自己建立的间接ELISA方法检测血清中特异性抗体效价。结果显示:4个免疫组在三次疫苗免疫后,均能产生高水平抗体,而S蛋白免疫组的蛋鸡血清特异性抗体效价均高于其他组。为筛选出卵黄抗体粉和卵黄抗体冻干粉最佳制作工艺,在第三次免疫7天后收集S蛋白免疫组的高免蛋制成卵黄抗体,采用喷雾干燥技术和冷冻干燥技术分别研制卵黄抗体粉和卵黄抗体冻干粉,并利用间接ELISA方法检测其抗体效价。结果显示,在加入保护剂后,通过控制一定的喷粉温度、优化喷雾干燥条件制粉,卵黄抗体在制备过程中出现平均1.71个滴度的损耗,这一工艺适合批量生产。初步应用高效价卵黄抗体对规模化猪场中患病仔猪进行治疗试验,对照组死亡率为82.50%;卵黄抗体粉组死亡率为25.33%;卵黄抗体液组死亡率为21.74%;卵黄抗体冻干粉组死亡率为24.07%。说明卵黄抗体制剂具有一定的临床有效性。