目的:利用表达绿色荧光蛋白的人乳腺癌细胞MDA-MB-231/GFP左心室注射法建立乳腺癌骨转移动物模型,采用基因芯片技术分析原代MDA-MB-231/GFP细胞和乳腺癌骨转移组织中基因表达方面的差异,进一步探索乳腺癌骨转移发生的分子机制。方法:1、将携带有GFP表达基因的质粒pEGFPN2采用阳离子脂质体转染法导入处于对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-231,建立稳定表达GFP的细胞系。采用分选型流式细胞仪分选MDA-MB-231和MDA-MB-231/GFP细胞,得到荧光细胞比例较高的细胞群体。绘制转染前后两组细胞的体外生长曲线,作统计学对比,确定转染是否影响细胞的生物学活性和致瘤性。2、扩增培养MDA-MB-231/GFP细胞,并收集该群中处于对数生长期的细胞,采用左心室注射法将肿瘤细胞种植于nu/nu裸鼠体内,每只1×10~7个/0.2ml,建立乳腺癌骨转移模型。观察裸鼠45天左右,做PET-CT检查,确定是否有乳腺癌骨转移发生,然后处死裸鼠。取部分转移组织,大小约为1.5cm×0.5cm×0.3cm做冰冻切片,以观察转移灶中绿色荧光蛋白的表达情况;余下转移组织10%中性福尔马林固定保存,行石蜡包埋切片,H.E染色,然后进行病理形态学观察,确认骨组织中有无肿瘤细胞浸润。解剖过程中,完整保存裸鼠的骨骼系统,以便做X线检查。3、差异基因分析:收集原代细胞和骨转移组织中的肿瘤细胞,分别提取其总RNA,寄往上海生物芯片有限公司,进行人类全基因组扫描和商业化的差异基因分析。4、根据差异基因分析结果,选择差异性比较显著的两个基因CXCR4和NF-KB做进一步研究,采用免疫组织化学检查分别观察两者在原代细胞和骨转移组织中的表达情况。结果:1、质粒pEGFPN2转染入人乳腺癌细胞MDA-MB-231后,G418初筛后获得稳定转染,分选型流式细胞仪分选获得荧光比例较高的MDA-MB-231/GFP细胞。转染前后两组细胞的生长曲线基本一致,说明MDA-MB-231/GFP的生物学活性和致瘤性未受到转染过程的影响。2、实验组裸鼠共16只,其中10只(62.5%)出现胸廓和肋骨等处的转移,4只(25%)出现肺转移,2只(12.5%)未见转移灶;PET-CT和X线检查能观察到骨侵蚀图像;解剖过程中肉眼观察到肺脏和胸廓等处有大小不等的圆形结节;冰冻切片显示转移组织中有绿色荧光蛋白表达且信号较强;病理切片结果提示肿瘤细胞浸润。3、差异基因分析结果:共有474个基因表达有差异,其中176个基因表达上调,298个基因表达下调。其中化学趋化因子受体CXCR4和核转录因子NF-KB在乳腺癌骨转移组织中表达明显上调,与原代细胞相比有明显差异。4、免疫组织化学检查结果显示,CXCR4在MDA-MB-231/GFP中表达较弱,只观察到少量的胞质中表达,在骨转移组织中表达较强,几乎整个胞质中均能观察到阳性表达。NF-KB表达情况与CXCR4一致,在乳腺癌骨转移组织中表达较原代细胞强。结论:GFP的整合及表达未对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长状态及生物学性状造成影响,可作为报告基因进一步研究乳腺癌骨转移的机制;左心室注射法最大程度模拟了临床上乳腺癌骨转移的发生和播散情形,应用该方法建立乳腺癌骨转移模型是可信的和可行的;基因芯片对于筛选乳腺癌骨转移相关基因有独特的优势,获得的差异表达基因具有较强的代表性,为寻找乳腺癌骨转移相关基因提供了重要线索;化学趋化因子受体CXCR4和核转录因子NF-KB在乳腺癌骨转移组织中的表达明显高于原代MDA-MB-231/GFP细胞,说明它们可能是导致乳腺癌骨转移发生的主要因素,可能成为乳腺癌骨转移治疗的新靶点。