【摘 要】
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前体RNA分子的精确剪接是基因转录后调控的一个关键步骤,相对于顺式剪接,反式剪接的作用机制、剪接模式及其进化等研究相对较少。反式剪接产生的新RNA不仅可以增加蛋白质组的复杂程度,还可以提供新的基因调控机制。自噬是通过自噬体和溶酶体途径降解细胞质成分和细胞器的一种分解代谢过程,自噬损伤会导致众多人类疾病,但是反式剪接调控自噬的研究仍未见报道。研究反式剪接在细胞自噬中的作用对于理解自噬在生理及病理中的
【基金项目】
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国家自然科学基金； 国家重点基础研究计划（973）； 国家科技支撑计划； 湖北省科技项目；
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前体RNA分子的精确剪接是基因转录后调控的一个关键步骤,相对于顺式剪接,反式剪接的作用机制、剪接模式及其进化等研究相对较少。反式剪接产生的新RNA不仅可以增加蛋白质组的复杂程度,还可以提供新的基因调控机制。自噬是通过自噬体和溶酶体途径降解细胞质成分和细胞器的一种分解代谢过程,自噬损伤会导致众多人类疾病,但是反式剪接调控自噬的研究仍未见报道。研究反式剪接在细胞自噬中的作用对于理解自噬在生理及病理中的功能都具有十分重要的意义。本研究利用RNA-seq数据库及实验验证,筛选得到反式剪接分子RpgrEef1a1,该分子在剪接拼接位点处都含有一段共同的重复序列,提示其反式剪接方式是重复拼接,符合转录滑动模型。体外模拟实验得到4条内源转录本和另外两条含有超表达载体序列的转录本Rpgr-Eef1a1 a和Rpgr-Eef1a1 b,这些转录本满足“GU-AG”剪接模式,RNA免疫共沉淀证实剪接体确实参与反式剪接过程。为了进一步研究反式剪接分子的功能,在小鼠卵巢组织、视网膜组织进行蛋白质免疫共沉淀实验,结果显示RPGR蛋白与RAB37蛋白相互作用,并且RPGR与RAB37三种形式进行蛋白质免疫共沉淀结果提示RPGR具有GEF活性。在GTP酶活性检测的实验中,RPGR只在RAB37存在GTP结合形式和GDP结合形式的循环中才会起作用。超表达RPGR时,野生型He La细胞中可以促进细胞自噬,mi R-RAB37细胞中却没有变化,提示RAB37是促进细胞自噬的效应分子,RPGR促进了自噬过程。蛋白质免疫共沉淀实验结果表明,RPGR-EEF1A1可以促进RPGR与RAB37间的相互作用。RPGR-EEF1A1包含完整的NB结构域和一部分RLD结构域1C,结果显示,RPGR-EEF1A1与RPGR有相同的GEF功能,GTP酶活性检测实验也显示相同结果。此外,免疫荧光和免疫印迹的结果表明,在野生型He La和mi R-RAB37细胞中超表达RPGR-EEF1A1,RPGR-EEF1A1可以增强RPGR与RAB37的互作,进而促进自噬。这些结果表明,RPGR-EEF1A1通过增强RPGR与RAB37的相互作用,参与自噬的调控。
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