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肥胖及其相关的代谢疾病已经引起人们的广泛关注。脂肪组织过多是肥胖的主要特点之一,已有研究表明,脂肪组织不仅是能量储存器官,还是一个活跃的内分泌器官。脂肪组织可产生和分泌多种脂肪因子,通过脂肪因子影响机体的代谢、胰岛素敏感性、心脑血管稳态、免疫系统、炎症等。因此,围绕脂肪因子开展一系列研究,对疾病的预防及治疗具有重要的意义。2008年,课题组发现一种新的脂肪因子Metrnl。Metrnl在皮下脂肪高表达,又被称为Subfatin。迄今为止,关于Metrnl功能的研究非常有限。据报道,Metrnl可促进白色脂肪棕色化、轴突生长、软骨细胞分化,以及增加胰岛素敏感性等。但是在进一步研究中,本课题组发现Metrnl缺乏相应的抗体工具,严重限制了对其开展深入研究。抗体用途广泛,在多种检测方法中不可或缺,如Western blot、ELISA、免疫组化、免疫共沉淀等。因此,本课题拟使用杂交瘤技术制备小鼠Metrnl单克隆抗体,进而通过初步的筛选鉴定,以期筛选出可用于后续Metrnl研究的小鼠单克隆抗体。实验方法1.小鼠Metrnl单克隆抗体的制备（1）设计小鼠Metrnl多肽抗原表位,合成后将其与载体蛋白偶联,以SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色检测多肽抗原的偶联情况。（2）将小鼠Metrnl基因与改造的pET-28a载体偶联,原核表达后,使用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色检测表达的蛋白;Western blot方法检测蛋白携带的His标签。（3）以多肽和小鼠全长蛋白为抗原免疫小鼠,免疫结束后一周取血,使用ELISA方法检测血清效价。选取效价较高的小鼠,取其脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,在HAT培养基上筛选杂交瘤细胞,随后进行两次亚克隆。选取状态良好的杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔内,收集腹水进行纯化。2.Metrnl全敲小鼠的培育及基因鉴定（1）使用MetrnlloxP/lox P小鼠和Ella-Cre小鼠杂交得到带有Ella-Cre基因的Metrnl杂合子小鼠(Metrnl+/-;Ella-Cre)。为去掉Ella-Cre基因,将Metrnl+/-;Ella-Cre小鼠与C57小鼠杂交,得到Metrnl杂合子小鼠(Metrnl+/-)。最后将Metrnl+/-小鼠自交,即可得到Metrnl-/-全敲小鼠及野生对照小鼠。使用PCR方法鉴定子代基因型。（2）使用Real-time PCR方法检测Metrnl全敲小鼠mRNA表达。（3）使用ELISA方法检测Metrnl全敲小鼠血清中Metrnl蛋白浓度。3.小鼠Metrnl单克隆抗体的鉴定和应用（1）使用Western blot方法以重组蛋白,C57结肠组织蛋白,WT、KO结肠组织蛋白对单克隆抗体进行鉴定。（2）将不同有效的单克隆抗体应用于免疫组化、免疫共沉淀检测。实验结果1.本课题共设计了14条多肽抗原序列,合成后将其与载体蛋白偶联,经检测其中一个偶联失败,其它均偶联成功。本课题又重新改造设计了一条多肽抗原并检测成功。2.小鼠Metrnl重组蛋白表达成功,且蛋白中含有His标签。3.根据ELISA检测免疫后小鼠血清效价的结果,选取效价较大的小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。在以小鼠Metrnl多肽抗原制备抗体的过程中选出56株阳性杂交瘤细胞,在以小鼠Metrnl蛋白制备抗体的过程中选出25株阳性杂交瘤细胞,共筛选出81株阳性杂交瘤细胞。4.以小鼠Metrnl全长重组蛋白鉴定所有腹水抗体。实验未能从56株Metrnl多肽抗原制备的抗体中筛选出有效抗体;由小鼠Metrnl全长蛋白制备的25株抗体中,有12株单克隆抗体可识别Metrnl重组蛋白。5.在C57小鼠各组织Metrnl mRNA表达检测中,结肠表达最高。6.本课题成功构建了Metrnl全身敲除小鼠,并在组织表达、血液水平上进行了验证。7.以小鼠结肠组织蛋白为样品鉴定12株识别重组蛋白的抗体,结果显示抗体并不适用于组织样品Western blot检测。8.将12株识别重组蛋白的抗体应用于免疫组化、免疫共沉淀检测,结果显示有不同的有效抗体。综上所述,本课题分别利用小鼠Metrnl多肽片段和全长重组蛋白免疫小鼠,共获得81株单克隆抗体,其中,由Metrnl全长蛋白制备的25株抗体中,有12株单克隆抗体可在Western blot检测中识别小鼠Metrnl重组蛋白,这些抗体有望在今后有关Metrnl的研究中发挥作用。在抗体的验证过程中,本课题成功构建了Metrnl全身敲除小鼠,可用于后续Metrnl功能研究。在12株能检测重组蛋白的单克隆抗体中,又进一步筛选出不同的抗体可应用于免疫组化、免疫共沉淀检测。