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着重研究家蚕蜕皮过程中发生的生理生化反应,以钙离子为主要研究对象,分别探讨钙、镁、磷脂酶C之间变化的相关性,以及利用钙拮抗剂分析细胞膜上钙离子通道的调控作用,可望阐明昆虫蜕皮过程中真皮细胞的信号转导途径,期望能为不蜕皮蚕的发生提供预防和防治提供新的思路。 本文通过制作家蚕体壁组织石蜡切片,利用免疫组织化学研究观察真皮细胞的蜕皮过程,结合组织块法与酶消化法培养原代真皮细胞,观察其形态特征与生长特性:运用原子吸收光谱法和酶联免疫法对家蚕幼虫蜕皮前后的体壁组织分别进行钙、镁离子含量以及磷脂酶C活力测定,探讨其与蜕皮有关的信号转导途径;选用五龄起蚕,添食48h不同浓度的氯化钙、氯化镧以及尼莫地平,分析各试剂对体壁组织中钙、镁元素以及蛋白含量变化的影响,并利用二氢吡啶类钙拮抗剂作用于sf-9细胞,分析其对细胞吸收钙镁离子量的变化,探讨钙离子通道对钙信号的调控作用。 获得结果如下:(1)体壁组织切片直观地反应了真皮细胞在眠期依次出现皮层融离、形成蜕皮膜间隙、真皮细胞有丝分裂、分泌形成新表皮、脱去旧表皮的整个过程,并成功分离培养出原代真皮细胞。(2)绘制出随着家蚕幼虫生长其体壁组织中钙、镁含量以及磷脂酶C活力的变化曲线。五龄前,只有在每龄蜕皮完成期钙含量显著高于其它生长时期,其余时间段则保持较低水平;镁含量则总体呈下降趋势,在各龄期的蜕皮前都有一次震荡回升:并且每个龄期都有一次钙下降、镁上升的反向变化时间段,且随龄期向后推迟;PLC的活性在眠前达到最高值,随后逐渐下降直到眠末,在蜕皮完成后活性再次上升;在五龄到预蛹期钙、镁含量以及PLC活力都相对处于较低水平。(3)检测氯化钙、氯化镧、尼莫地平对家蚕体壁组织中钙离子和镁离子浓度的影响。与正常饲喂的对照组相比较,尼莫地平组钙含量显著升高,高浓度氯化镧处理组镁含量显著性降低,体壁组织中总蛋白含量均有不同程度增加,但其中钙调蛋白含量比率差异不明显,氯化镧组与尼莫地平处理组蛋白表达量略有下降。蚕粪中钙含量均有不同程度降低。用体外培养的sf-9细胞研究钙拮抗剂对钙镁吸收量的影响,发现经二氢吡啶类钙拮抗剂处理后,细胞对钙的吸收量无明显减少,但对镁的吸收量均显著性减少。 利用组织切片技术证实家蚕真皮细胞在蜕皮激素的诱导下,新旧表皮交替更新全过程,并鉴定了其形态特征与生长特性;PLC在真皮细胞蜕皮应答过程中介导了由蜕皮激素诱发的钙信号转导级联反应,并处于初级阶段,且随着蜕皮激素的非持续作用而活性降低,由处于下游产生的钙信号促使真皮细胞完成蜕皮过程,在此过程中,Mg2+能对钙的流向产生调控作用。钙离子通道、钙结合蛋白以及镁能通过自身特性在细胞钙信号转导途径中发挥重要作用。这些结果有助于进一步了解家蚕蜕皮的分子机制,也为不蜕皮蚕的预防防治提供了新的思路。