背景与目的呼吸道感染（respiratory tract infection,RTI）是致病微生物侵入呼吸道导致的疾病。鼻病毒（rhinovirus,RV）是引起RTI常见的病原体之一,在全球范围内流行。EV-D68（enterovirus D68,EV-D68）的生物学特征与RV相似,呼吸道是其生长繁殖的首选靶点。EV-D68感染主要引起RTI症状,部分患者可出现急性弛缓性脊髓炎（acute flaccid myelitis,AFM）。目前,肠道病毒（enterovirus,EVs）引起RTI的病原学和分子流行病学相关研究较少,且临床中缺乏针对呼吸道中EVs的特异诊断方法。本研究利用多病原检测方法,旨在探究RTI患者中EVs检出的病原谱,进一步分析RV和EV-D68的流行病学特征。此外,对EV-D68阳性样本核酸进行测序,旨在对广州地区2018年至2022年EV-D68序列进行基因组特征分析。研究对象和方法收集2020年4月至2022年3月广东省第二人民医院RTI患者的肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）或鼻咽拭子（nasopharyngeal swabs,NAPS）样本和2021年12月至2022年3月广东省妇幼保健院RTI患者的BALF及个案信息调查表。将BALF和NAPS样本进行多病原检测后结合人口学信息分析呼吸道中EVs的病原谱和流行特征。同时收集本课题组前期研究的EV-D68阳性样本7份,利用敏感细胞进行EV-D68分离。最后,对分离成功的EV-D68病毒液和未分离成功的EV-D68阳性样本核酸进行二代测序和宏基因组测序。结果1、2020年4月至2022年3月纳入RTI患者552例。成人BALF和NAPS中EVs检出阳性率分别为13.90%和12.74%,以RV感染为主,其次是EV-D68。儿童BALF中EVs检出阳性率为24.72%,以RV感染为主,未检出EV-D68,未能成功对其它EVs进行血清分型。2、RV感染全年均可发生。基于性别、样本类型和就诊年份的不同,RV检出阳性率差异无统计学意义。RV在＜1.13岁年龄组易感。BALF和NAPS样本RV检出的一致性为0.236,一致性较差。本研究EV-D68检出阳性为6例,同时收集2018年12月至2019年8月RTI患者中EV-D68检出阳性7例。EV-D68感染以肺炎和RTI症状为主,未发现与神经系统相关的症状。3、13例EV-D68阳性患者的样本中,6份样本核酸成功测序,均为A2基因亚型,与2014—2018年广东地区流行的B3亚型不一致。系统发育树结果发现与我国2019年上海流行的EV-D68毒株相似。本研究EV-D68序列基于5’UTR、P1、P2和P3区构建的系统进化树均与基于VP1区构建的系统进化树基因分型一致。经Simplot 3.5.1软件分析未发现基因重组事件。4、相较于Fermon原型株,本研究所得序列在5’UTR和P1编码区存在碱基缺失和碱基插入,在P1、P2和P3编码区有多个位点的氨基酸突变现象。VP1编码区有64个变异位点,占P1编码区总变异位点数63.37%。P1-aa143、aa558、aa647、aa650和aa770是位于P1编码区的高突变位点,其中P1-aa558、aa647、aa650和aa770位于VP1编码区。5、在中国EV-D68检出主要以A2和B3基因亚型为主,尚未发现C基因型在中国流行。结论本研究结果表明2020年4月至2022年3月广州市呼吸道EVs感染以RV感染为主,其次是EV-D68。RV全年均可感染,在＜1.13岁年龄组易感。BALF和NAPS样本RV检出的一致性为0.236,一致性较差。EV-D68感染以肺炎和RTI症状为主。2019年和2020年广州市EV-D68均属于A2基因亚型,与我国2019年上海流行的EV-D68毒株相似,但与2014—2018年广东地区流行的B3亚型不一致,EV-D68流行株在广州市可能发生改变。因此,还需持续监测EVs中EV-D68感染的基因流行特征,为临床诊疗和预防控制提供依据。