红斑丹毒丝菌感染猪导致猪丹毒,主要引起猪的败血症、心内膜炎和多发性关节炎。2010年以来,我国多个省份均出现了猪丹毒的大范围流行,给猪场造成了巨大的经济损失。虽然红斑丹毒丝菌成为严重危害养猪业的传染病病原,但关于其致病机制和免疫机制的研究还相对滞后。红斑丹毒丝菌的致病机制不明确成为防控猪丹毒最大的阻碍,新毒力(相关)因子及毒力调控基因的发掘以及功能研究是目前红斑丹毒丝菌致病机理研究的关键。本研究力图系统性发掘红斑丹毒丝菌新的毒力(相关)因子,为进一步研究红斑丹毒丝菌致病机制奠定基础。鉴于革兰氏阳性菌的细胞壁相关蛋白在细菌的粘附、侵入等致病过程中发挥重要作用,本研究以红斑丹毒丝菌的细胞壁相关蛋白为研究对象,利用i TRAQ结合LC-MS/MS的方法鉴定了强弱毒菌株差异表达的细胞壁相关蛋白,并对鉴定到的潜在的毒力相关因子Sbp进行了验证,评价了Sbp制备的亚单位疫苗对仔猪的免疫保护效果。在90年代初期,我国通过疫苗免疫等防控手段,使得猪丹毒疫情得到控制。如今猪丹毒这一“老病”新发,也提出了许多问题:是否现有疫苗预防不理想?或是临床流行的红斑丹毒丝菌耐药性发生了变化?为了给当前防控猪丹毒提供科学的用药指导,本研究对红斑丹毒丝菌临床分离株进行了21种常用药物的耐药谱检测。并进一步对红斑丹毒丝菌耐喹诺酮药物的机制进行了初步探索。本研究的主要成果总结如下:1.红斑丹毒丝菌比较蛋白质组学研究本研究以红斑丹毒丝菌的强毒菌株和弱毒菌株的细胞壁相关蛋白为研究对象,利用i TRAQ结合LC-MS/MS的方法鉴定差异表达蛋白,共鉴定到100个差异表达的细胞壁相关蛋白。强毒菌株中高表达蛋白为57个,主要为ABC转运蛋白和粘附相关蛋白;低表达蛋白为43个,主要为压力反应蛋白。强毒菌株中高表达的蛋白可能跟细菌毒力相关,本研究选取强毒菌株中高表达的部分蛋白,利用原核表达系统表达重组蛋白,纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,通过Western Blot检测其在强弱毒菌株中的实际表达情况,其表达情况与i TRAQ结果一致。对强毒菌株高表达的蛋白进行分析,发现糖转运蛋白Sbp在强毒菌株中表达量为弱毒菌株的1.73倍。Sbp蛋白被报道参与细菌双精氨酸转位通路,是一些细菌重要的毒力因子。为了验证Sbp在红斑丹毒丝菌致病过程中发挥的作用,本研究利用同源重组原理构建了sbp基因缺失突变菌株。sbp基因缺失后,红斑丹毒丝菌粘附侵入猪髋动脉内皮细胞(PIEC)的能力显著下降,其在健康猪全血中的存活率也显著下降,同时其抵抗小鼠吞噬细胞吞噬的能力也降低。动物感染实验结果显示:与野生菌相比,sbp基因缺失菌株对猪的致病力下降。这些结果表明Sbp是红斑丹毒丝菌重要的毒力相关因子。同时,病原菌表面的毒力相关蛋白通常也是其重要的保护性抗原,所以本研究利用仔猪模型评价Sbp蛋白的保护效力。在本研究中,纯化的重组Sbp蛋白能够诱导仔猪产生高水平的抗体,并保护66.7%的仔猪抵抗致死剂量的红斑丹毒丝菌人工感染。抗体跟踪检测表明Sbp诱导的抗体可持续最少6个月。结果表明Sbp是一个有效的疫苗候选蛋白。2.红斑丹毒丝菌耐喹诺酮药物机制初探本研究用药敏纸片法检测了红斑丹毒丝菌临床分离株对21种常用药物的耐药谱,旨在了解当前流行株的耐药情况,为临床用药提供参考。进一步利用E-test药敏纸条检测临床分离株对环丙沙星和左旋氧氟沙星(喹诺酮类药物)的MIC值,根据CLSI标准,判定临床分离的红斑丹毒丝菌对环丙沙星的耐药率为48.8%,且不同菌株之间对环丙沙星药物的MIC值呈现多样性。进一步通过测序分析喹诺酮耐药相关基因DNA解旋酶(Gyr A、Gyr B)和拓扑异构酶Ⅳ(Par C、Par E)的突变情况,结合各菌株对环丙沙星药物的MIC,发现了2个耐药相关基因突变位点:Gyr A(90D→N)和Par C(81 S→I)。进一步对这两个位点进行了定向点突变实验,结果发现Gyr A90位点的突变能使红斑丹毒丝菌对环丙沙星的MIC值升高3倍。