钙调素(Calmodulin,CaM)是真核细胞中Ca2+的主要受体,是钙信号系统的核心蛋白。Ca2+-CaM参与调节了真核生物许多重要生命活动,但由于高等动、植物的遗传复杂性,很难用基因标记和敲除等方法研究其在活细胞中的定位模式和功能。构巢曲霉具有结构简单、遗传背景清楚、遗传可操作性等特征,因此,本课题以构巢曲霉为模式生物,系统、全面地跟踪了CaM在孢子萌发、孢子形成发育、菌丝顶端极性生长、胞质分裂和有丝分裂过程中的动态定位,并研究了CaM相关功能。
　　 本课题利用启动子替换技术、融合PCR技术以及绿色荧光蛋白标记技术构建并鉴定了乙醇脱氢酶启动子调控的GFP-CaM菌株和自身启动子调控的CaM-RFP菌株,利用这两株菌全面研究了CaM在构巢曲霉生长发育过程中的时空分布。结果发现CaM定位于极性生长过程中的菌丝顶端、胞质分裂过程中隔形成位点、产孢过程中的特定部位、细胞核中以及有丝分裂过程中纺锤体两极上。在定位研究的基础上对CaM在极性生长和胞质分裂过程中的生物学功能进行了进一步的研究,结果表明在极性生长过程中旺盛生长的菌丝顶端以及新形成的分枝顶端始终有CaM定位,位置与顶体重合,低温处理导致CaM在顶端缺失并引起生长停滞。利用cytochalasin D破坏微丝、Nocodazole破坏微管都会影响到CaM在顶端的定位,马达蛋白KipA缺失使CaM在顶端位置发生偏移,菌丝表现为弯曲生长。以上现象说明CaM在菌丝顶端的定位和功能受到微丝、微管、马达蛋白的影响。微管缺陷导致CaM在菌丝顶端聚集量减少,影响了CaM长距离运输到顶端的过程；马达蛋白KipA调控微管正端在菌丝顶端的锚定,KipA缺失没有影响CaM向顶端的运输,但使CaM偏离中央位置导致生长方向变化；微丝细胞骨架缺陷使CaM在顶端随机分布,影响了CaM从顶体向细胞表面的短距离分运,从而破坏了菌丝的极性。在胞质分裂过程中CaM短时高浓度定位在胞质分裂隔形成位点,关闭CaM的表达导致隔不能形成,证明了CaM在隔形成部位的短时定位是胞质分裂顺利进行所必需的。本论文的研究成果揭示了CaM参与调控构巢曲霉极性生长、胞质分裂等生物学过程的新功能,为细胞重要生命过程的调控以及进一步筛选抗真菌药物提供了理论依据。