E1A基因对肿瘤放射敏感性的影响及机理探讨

来源 :中国协和医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cnanjr
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目的:利用外源性基因改变肿瘤原有的放射敏感性使其对放疗敏感,从而为提高肿瘤放射治疗疗效提供途径。方法:利用本实验室构建的含腺病毒(Ad5)早期表达基因E1A的pcDNAⅢ质粒转染肺腺癌Anip-973(含mtp53)细胞,G418筛选后,经PCR和RT-PCR鉴定,获得含E1A的阳性克隆,用E1A单克隆抗体细胞化学染色证明E1A蛋白在细胞内表达。细胞计数法制作细胞生长曲线观察转染前后细胞生长情况。将未转染的Anip-973细胞、转染pcDNA空载体质粒的Anip-973细胞(Anip-973-vect)和转染E1A的Anip-973细胞(Anip-973-E1A)给5Gy单次照射后,不同时间用MTT法测细胞存活;取0、1、2、3、5、7、10Gy剂量点,用6MV的X线单次照射后,培养13天,计数克隆,制作放射存活曲线,以测定E1A对肿瘤细胞放射敏感性的影响。5Gy单次照射后,用流式细胞仪测凋亡及细胞周期,以检测E1A对照射后细胞的凋亡和细胞周期阻滞的影响。细胞化学染色检测转染前后mtp53、Rb、erbB-2的表达,以分析E1A增敏机理。结果:①转染后的阳性克隆细胞PCR及RT—PCR电泳鉴定结果说明:E1A已整合到细胞基因组中并且稳定表达。②免疫细胞化学染色证明:Anip-973细胞mtp53、RB、erbB-2/neu蛋白均有表达,Anip-973-E1A细胞中E1A蛋白得到高表达。Anip-973-E1A细胞的erbB-2/neu蛋白表达降低,而mtp53、RB无变化。③5Gy单次照射后不同时间转染前后的细胞存活以14小时最低,未转染的Anip-973细胞与Anip-973-E1A细胞14小时存活率分别为:69.5%、41.5%。经t检验有显著差异(t=4.303,p=0.02)。④细胞放射存活曲线结果显示:未转染的Anip-973细胞D0=1.14,Dq=1.53;Anip-973-vect细胞D0=1.13,Dq=1.44;Anip-973-E1A细胞D0=1.02,Dq=0.8。用D0值计算的增敏比=1.12。未转染的Anip-973细胞和Anip-973-vect细胞照射后细胞存活无明显差异,Anip-973-E1A细胞照射后细胞存活明显下降,存活曲线的肩区变窄,Dq值降低。⑤未照射情况下Anip-973-E1A细胞、未转染的Anip-973细胞G2期细胞比例分别为14.8%和7.8%,说明E1A转染后使G2期细胞的比例升高。5Gy单次照射后分别于3、7、11、15、20、25、30和35小时进行流式细胞仪检测,结果照射后三种细胞均未发生G1期延迟,而在S期和G2
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