研究背景高血压是世界上常见的危害人类健康的疾病,是诱导中风、心肌梗死、血管疾病及慢性肾脏疾病的主要因素之一。高血压是心肌纤维化病变的主要因素,可导致病理学特征的心肌损害。高血压引起心脏压力负荷持续增加,引发间质和血管周围胶原纤维的过度增生和异常积累,最终导致心肌纤维化。心肌纤维化是慢性心脏病的一个重要组成部分,被越来越多地认为在慢性心脏病的病程进展中起重要作用。因此,预防和治疗心肌纤维化具有巨大的临床价值和社会意义。目前认为,心肌纤维化是多种常见的心脏疾病向终末期心脏病发展的一个必然过程,是心功能由代偿期向失代偿期转变的一个关键时期。心肌纤维化是决定心血管疾病预后的一个关键性的因素,形成的机制非常复杂,涉及多种细胞因子。其中研究较多的是转化生长因子p,它被公认是器官纤维化的治疗靶标。TGF-β是拥有众多细胞因子成员的大家族,研究较多的是其中重要的TGF-βs。在哺乳动物中只发现了TGF-β2和TGF-β3这3种形式。其中TGF-β1主要有由成纤维细胞产生,在心肌纤维化的发生、发展过程中,’TGF-β,发挥促肌性成纤维细胞的转化、促胶原基因表达、促细胞外基质合成等作用,是最重要的促心肌纤维化的细胞因子之一。种种研究表明,病理性TGF-β,的增加在心肌纤维化的增殖和变异中起着关键的作用,抗TGF-β1的治疗无疑将成为心肌纤维化防治的重要策略。近年来针对TGF-β1在心肌纤维化领域的治疗研究已取得进展,但是其临床疗效有待进一步确认。Smads为TGF-β信号通路中的下游转导蛋白,它可以将TGF-β信号由细胞膜表面直接传送到细胞核内。TGF-β作为配体,与受体相结合后,激活Smads蛋白转导进入核内,共同调节靶基因转录。哺乳动物中的Smads蛋白至少有8种,按结构和功能可分为3个亚型：(1)受体激活型Smads,包括了Smad1、2、3、5和8。(2)共同介质Smads,在哺乳动物中为Smad4 (3)抑制型Smads,包括了Smad6、7。TGF-β/Smads信号转导通路中各种类型Smads分子之间作用精密协调,共同完成了生理以及病理状态下TGF-β的生物学效应。传统中医多采用中药复方对患者进行治疗。当前许多中医疗法的疗效被证实是由多种因素介导的。这些药方中的药理活性成分许多已被探明,其中部分被报道对多种疾病有显著的疗效,例如肿瘤、炎症、心血管疾病等。高血压心肌纤维化属于中医理论中“心悸”、“喘证”、“水肿”等范畴。血府逐淤汤是由桃红四物汤改进而来,由十一味中药组成,近年来临床上广泛用于高血压心脏病的治疗。许多中医学相关文献报道服用中药方剂血府逐淤汤对治疗高血压相关症状诸如头痛头晕等疗效显著,然而这些复方的潜在作用机制和治疗效果尚不清楚。研究目的本课题以白发高血压大鼠为实验对象,不同剂量血府逐淤汤予以灌胃给药,观测药物对自发高血压大鼠心肌纤维化的影响。检测心肌组织中TGF-β及Smad2、3、7蛋白的表达情况,初步探究血府逐淤汤逆转心肌纤维化的作用机制。为临床使用血府逐淤汤治疗心肌纤维化提供实验依据。研究方法1.25只SHR大鼠随机分为5个实验组,每组5只,此外另设5只WKY大鼠为阴性对照组,共六组：(1)WKY对照组;(2)SHR对照组；(3) SHR+6g·kg-1血府逐淤汤组；(4) SHR+12g·kg-1血府逐淤汤组；(5) SHR+18g·kg-1血府逐淤汤组;(6)SHR+60mg·kg1卡托普利组。各组大鼠均灌胃给药,WKY对照组和SHR对照组分别给予等量蒸馏水。每日上午10点整给药一次,连续给药16周。2.大鼠尾动脉压测量仪检测给药前后尾动脉收缩压,探究药物对SHR血压的影响。3.将大鼠麻醉处死,采集心肌组织并做相应处理,为后续相关实验提供实验样本。4.样本碱水解法检测心肌组织羟脯氨酸含量,估算心肌胶原蛋白含量。5.心肌组织的固定及石蜡切片标本的制作。6. Masson三色胶原染色进行心肌组织病理学检测,计算胶原蛋白容积分数。7.免疫组化法观测心肌组织中TGF-β1蛋白的分布及表达。8.荧光实时定量PCR检测心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7 的 mRNA表达。9. Western blot法检测心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表达。实验结果1.药物对大鼠血压的影响SHR大鼠血压显著高于WKY大鼠,有统计学差异(P<0.01)；灌胃给药后卡托普利组大鼠血压显著降低,有统计学差异(P<0.05),而其余各组血压变化不明显。2.心肌组织羟脯氨酸含量测定羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色,根据其成色深浅可推算胶原含量。SHR对照组大鼠心肌组织羟脯氨酸含量显著高于WKY对照组,有统计学差异(P<0.001)；卡托普利及高剂量血府逐淤汤组相对于SHR对照组羟脯氨酸含量显著降低(P<0.001)；中剂量血府逐淤汤组也能明显降低羟脯氨酸含量(P<0.05)；而低剂量血府逐淤汤组对羟脯氨酸影响不明显,无统计学差异(P>0.05)。3. MASSON三色胶原染色检测心肌组织纤维化程度经MASSON染色后,心肌胶原纤维呈现蓝色,心肌肌纤维呈现红色,胞浆呈蓝黑色。使用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测量并分析胶原面积,计算胶原蛋白容积分数(CVF)。SHR对照组CVF值显著高于WKY对照组,有统计学差异(P<0.05)；卡托普利组相对于SHR对照组CVF值显著降低(P<0.01)；高剂量血府逐淤汤组CVF值也能明显降低(P<0.05)；而低剂量及中剂量血府逐淤汤组CVF值相比SHR对照组差别不明显,无统计学差异(P>0.05)。4.免疫组化法检测心肌组织中TGF-β1蛋白表达使用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统分析,以胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表现,分别测出阳性反应细胞的累计光密度值(IOD)和分布面积(Area),计算出平均光密度值(Density),反映TGF-β1蛋白相对含量。SHR对照组TGF-β1蛋白含量显著高于WKY对照组,有统计学差异(P<0.05)；卡托普利及高剂量血府逐淤汤组相对于SHR对照组TGF-β1蛋白含量显著降低(P<0.05)；而低剂量及中剂量血府逐淤汤组TGF-.β1蛋白含量相比SHR对照组差别不明显,无统计学差异(P>0.05)。5.荧光实时定量PCR检测心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表达Real Time PCR反应结束后确认扩增曲线、融解曲线及Ct值,使用2-△△Ct法计算各目标基因的相对起始模板溶度。SHR对照组对比于WKY对照组,TGF-β1、Smad2、3的mRNA表达明显升高,Smad7的mRNA表达含量明显降低,具有显著性差异(P<0.05)；卡托普利组对比于SHR对照组,TGF-β1、Smad2、3的mRNA表达明显降低,Smad7的mRNA表达含量明显升高,具有显著性差异(P<0.05)；高剂量血府逐淤汤组对比于SHR对照组,TGF-β1、Smad2的mRNA表达明显降低,Smad7的mRNA表达含量明显升高,具有显著性差异(P<0.05),但Smad3的mRNA表达变化不明显,无统计学差异(P>0.05)；低剂量及中剂量血府逐淤汤组对比于SHR对照组TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表达均无显著差异(P>0.05)。6. Western blot法检测心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表达胶片进行扫描,用Image-pro Plus 6.0图像分析软件分析目标条带的光密度值,观测各蛋白含量表达。SHR对照组对比于WKY对照组,TGF-β1、Smad2、3蛋白含量明显升高,Smad7蛋白含量明显降低,具有显著性差异(P<0.05)；卡托普利组对比于SHR对照组,TGF-β1、Smad2、3蛋白含量明显降低,Smad7蛋白含量明显升高,具有显著性差异(P<0.05)；高剂量血府逐淤汤组对比于SHR对照组,TGF-β1、Smad2蛋白含量明显降低,Smad7蛋白含量明显升高,具有显著性差异(P<0.05),但Smad3含量变化不明显,无统计学差异(P>0.05)；低剂量及中剂量血府逐淤汤组对比于SHR对照组TGF-β1、 Smad2、Smad3、Smad7蛋白含量表达均无显著差异(P>0.05)。实验结论(1)血压大鼠相比于wistar大鼠,收缩压升高,心肌胶原蛋白含量增加,心肌组织中能观察到显著的纤维化病变,与相关文献报到一致。(2)高剂量组血府逐淤汤逆转心肌纤维化效果显著,但降压效果不明显,提示其逆转心肌纤维化作用可能不是通过降低心脏压力负荷实现的。(3)通过对心肌组织TGF-β/Smads信号转导通路相关基因的mRNA和蛋白含量表达的检测发现,高剂量组血府逐淤汤显著降低TGF-β1、Smad2的表达,Smad7表达明显提升,初步证实其逆转心肌纤维化作用可能是通过调节TGF-β/Smads通路实现的。