研究背景糖尿病(diadetesmellitus,DM)是全球主要的慢性疾病之一,全世界约有3亿人罹患糖尿病,并且糖尿病前期患者数量仍在增加。根据流行病学调查,预计2030年将有4.5亿。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)作为糖尿病并发症之一,因其导致严重的心血管事件而引发关注。糖尿病心肌病是一种特异性的心肌疾病,与冠状动脉粥样硬化、高血压、心脏瓣膜病以及其他心脏病变无关,临床表现为早期的无症状的舒张功能障碍,晚期则发展为有症状的充血性心力衰竭。目前对糖尿病心肌病的机制研究主要集中于糖毒性、脂毒性、胰岛素抵抗、心肌纤维化、心肌肥大、心肌细胞凋亡及坏死、氧化应激等方面。心肌纤维化是糖尿病心肌病的主要病理变化,心肌纤维化增加心肌硬度,降低心肌顺应性,最终发展为心脏舒张、收缩和传导功能障碍,同时伴有动脉血管壁增生,使管腔缩小,降低毛细血管密度,减低心肌血氧供应,造成心脏功能损伤。研究发现冠状动脉微循环障碍是糖尿病患者心肌间质纤维化的重要原因,因此减轻微循环障碍引起的内皮功能障碍可能是有效缓解糖尿病心肌病进展的重要措施之一。因此增加毛细血管密度,促进血管生成,增加血氧供应,可以为糖尿病心肌病的治疗带来曙光。然而目前对糖尿病心肌病的微血管病变研究较少,因此探寻有效的药物促进血管生成并研究其作用机制具有重大的临床及实践意义。丹参多酚酸B(Salvianolic Acid B,Sal B)是中药丹参的主要化学成分之一。研究发现,丹参多酚酸B可以减轻缺血再灌注导致的心肌损伤,降低脑梗死模型动物的脑梗死体积和神经功能缺损评分,其作用可能是通过改善微循环障碍,促进血管生成有关。另外有研究表明,丹参多酚酸可以增加内皮细胞数量,促进内皮细胞管状结构生成,增加血管生成相关标志物VEGFA、VEGFR2、ANGPT1、ANGPT2、Tie2等的表达。因此,本研究中利用链脲佐菌素诱导小鼠1型糖尿病模型,明确丹参多酚酸B能否通过促进血管生成从而减轻糖尿病心肌病并深入探讨其分子机制,为中医药防治糖尿病心肌病提供思路,为中医药的进一步推广应用提供参考。研究目的1.研究丹参多酚酸B对糖尿病小鼠心肌重构及纤维化的作用;2.研究丹参多酚酸B对糖尿病心肌病小鼠血管生成的作用及机制。研究方法1.动物模型建立及丹参多酚酸体内给药C57BL/6J小鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)溶液以构建1型糖尿病小鼠模型,并随机分为3组:糖尿病模型组、丹参多酚酸B低剂量治疗组(15mg/kg/d)、丹参多酚酸B高剂量治疗组(30mg/kg/d)。糖尿病造模成功后,丹参多酚酸B高低剂量治疗组小鼠开始以腹腔注射方式给予相应浓度的丹参多酚酸B干预,每日1次,正常对照组及糖尿病模型组小鼠给予等量的生理盐水腹腔注射。丹参多酚酸B干预16周后,小鼠麻醉处死,留取血液及组织标本备用。2.超声心动图检测心功能小鼠取材前,采用多普勒超声成像技术评估各组小鼠的心脏功能,检测左心室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(FS)、早晚期二尖瓣流入血流速度比(E/A)和舒张早晚期二尖瓣半环速度峰值比(E’/A’)。3.组织学染色实验末期,收集各组小鼠心脏,浸泡于4%多聚甲醛中固定,按照标准步骤脱水,制备石蜡切片,H&E染色观察心脏大体形态及心肌细胞直径,天狼猩红及Masson染色检测心肌间质胶原含量,ColI、ColIII免疫组织化学染色观察相关胶原蛋白的表达,CD31免疫组化染色观察心肌中毛细血管密度。4.组织荧光免疫组化各组小鼠心脏石蜡切片,常规脱腊后,组织荧光免疫组化显示α-SMA及CD31的分布及表达情况。5.蛋白免疫印迹剪取心脏组织或收集刺激后细胞,提取蛋白,经过凝胶电泳、转膜等步骤检测相应蛋白在组间的表达差异。6.转录组测序收集各组小鼠心肌组织,进行转录组测序以探究其分子机制。7.实时定量RT-PCR剪取心脏组织或者收集细胞后,提取RNA,经过逆转录、PCR扩增等检测相关基因的mRNA在组间的表达差异。8.细胞培养HUVECs购买于美国ATCC公司,用含5%胎牛血清及1%生长因子的ECM培养基培养,常规方法换液及传代。9.CCK-8 检测HUVECs种植于96孔板中,给予0、10、50、100、1000ug/ml的丹参多酚酸B干预,24h后在酶标仪中检测各孔OD值以评价细胞活性。10.体外成管实验检测HUVECs分为对照组、乏氧组、Sal B组。将基质胶预先在4℃条件下过夜融化,第二天铺板,预冷的吸头吸取70ul基质胶到24孔板中,置于37℃孵箱中孵育30min,待其成胶。将经历不同的刺激之后的各组细胞,取200ul各组细胞悬液(密度:4*104/ml)铺到胶上。4小时后,倒置显微镜下观察细胞间管状结构形成程度并拍照保存。11.细胞免疫荧光化学染色采用细胞免疫荧光检测IGFBP3在各组间核转位情况。12.启动子甲基化检测收集各组细胞,进行启动子区域的甲基化水平检测。13.基因表达的干预在体外实验中,利用瞬时转染siRNA-IGFBP3的方式抑制内皮细胞IGFBP3的表达。14.细胞的迁移实验利用划痕实验及Transwell小室检测丹参多酚酸B对细胞迁移能力的影响。15.细胞周期利用流式细胞术检测细胞周期的分布。16.统计学分析应用SPSS 18.0软件分析处理实验数据,结果以平均数+标准差表示。组间变量采用单因素方差分析检验,P小于0.05认为有统计学差异。研究结果1.小鼠的一般特性1型糖尿病造模成功后,小鼠的尾静脉随机血糖水平明显升高。低剂量或高剂量的丹参多酚酸B药物干预后,对随机血糖的影响未见明显变化。糖尿病小鼠造模成功后即出现消瘦、多饮、多食等症状,给予高低剂量的丹参多酚酸B治疗后可缓解上述糖尿病小鼠的症状。2.丹参多酚酸B能够减轻糖尿病小鼠的心肌重构及心功能异常各组小鼠给予丹参多酚酸B等相应干预16周后,观察各组小鼠心脏形态及功能变化。相较于正常组小鼠,糖尿病组小鼠表现为心脏变大、心尖圆钝、心肌细胞横截面积增加。高低剂量丹参多酚酸B药物治疗后,相较于糖尿病组,心脏缩小、室壁变薄及心肌细胞横截面积降低。通过测量心重量及体重,丹参多酚酸B药物降低了糖尿病小鼠的心脏体重比(HW/BW)。相较于正常对照组小鼠,糖尿病导致小鼠心脏功能下降,而高低剂量的丹参多酚酸B治疗可提高心功能指标,增强糖尿病小鼠心功能。然而各组小鼠左室长轴切面左室舒张末期内径(LVEDd)未见统计学差异。3.丹参多酚酸B能够减轻糖尿病小鼠的心肌纤维化组织学染色结果显示,相较于正常对照组小鼠,糖尿病导致小鼠心肌组织中胶原纤维明显增多,表现为心脏的广泛纤维化;丹参多酚酸B干预能够减低糖尿病小鼠心肌组织胶原含量及Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达。4.丹参多酚酸B增加糖尿病小鼠心肌组织血管生成CD31的免疫组织化学染色结果显示,与正常组小鼠相比,糖尿病小鼠CD31蛋白表达显著减少,即毛细血管密度降低,高、低剂量的丹参多酚酸B干预后,糖尿病小鼠心肌组织中CD31表达增加,提高了毛细血管密度。应用CD31和α-SMA荧光共定位染色显示,糖尿病小鼠心肌中成熟血管数量明显少于正常组小鼠,而高、低剂量的丹参多酚酸B治疗可改善上述变化。Western blot检测结果显示糖尿病小鼠心肌组织血管内皮生长因子VEGFA及其受体VEGFR2表达减少,而丹参多酚酸B治疗可促进其表达,实验结果与免疫组化结果一致。5.丹参多酚酸B通过降低IGFBP3表达促进血管生成小鼠心肌组织的转录组测序结果显示,糖尿病小鼠心肌中IGFBP3高表达,而高低剂量的丹参多酚酸B治疗后可降低IGFBP3的水平。心肌组织实时定量RT-PCR结果进一步表明,高低剂量的丹参多酚酸B治疗可改善糖尿病小鼠心肌中IGFBP3 mRNA水平的高表达。6.丹参多酚酸B通过激活p-AKT和p-ERK信号通路促进血管生成各组小鼠心肌组织免疫印迹实验结果表明,高、低剂量的丹参多酚酸B治疗组小鼠心肌组织中AKT及ERK信号通路的磷酸化水平升高。7.丹参多酚酸B增强脐静脉内皮细胞的活性CCK-8实验显示,50ug/ml的丹参多酚酸B对内皮细胞活性的促进作用最强,故50ug/ml的丹参多酚酸B用于随后的试验中。8.丹参多酚酸B促进HUVECs血管生成Western blot实验表明,丹参多酚酸B治疗乏氧环境中的HUVECs 24h更能促进VEGFA、VEGFR2的表达。体外细胞成管实验表明,乏氧环境下内皮细胞的成管能力显著降低,而丹参多酚酸B治疗则可以挽救细胞降低的成管能力。9.丹参多酚酸B促进IGFBP3向胞浆转位蛋白免疫印迹检测及细胞免疫荧光检测表明,乏氧条件下内皮细胞内IGFBP3主要在胞核内表达,胞浆内表达较少,给予丹参多酚酸B治疗后,胞核内IGFBP3表达降低,胞浆中表达增多。10.丹参多酚酸B增强IGFBP3启动子区域甲基化丹参多酚酸B降低IGFBP3表达是通过增强IGFBP3启动子区域甲基化实现的。11.丹参多酚酸B通过抑制IGFBP3增强细胞成管能力利用siRNA抑制IGFBP3表达后,基质胶内细胞成管能力增强。12.丹参多酚酸B通过抑制IGFBP3促进细胞迁移划痕实验及transwell小室实验结果表明,抑制IGFBP3表达后乏氧环境下内皮细胞迁移能力增强。13.丹参多酚酸B通过抑制IGFBP3促进细胞增殖流式细胞术检测结果表明,抑制IGFBP3活性后,乏氧环境下内皮细胞处于S期及G2期比例增加,促进了内皮细胞的增殖。14.丹参多酚酸B通过p-AKT及p-ERK信号通路调控IGFBP3的表达蛋白免疫印迹实验显示丹参多酚酸B治疗或si-IGFBP3均能增加AKT及ERK磷酸化水平。研究结论1.丹参多酚酸B能够减轻糖尿病小鼠心肌重构、心肌纤维化及心脏功能;2.丹参多酚酸B通过降低IGFBP3活性促进糖尿病心肌病小鼠心肌血管生成;3.丹参多酚酸B能够促进IGFBP3的胞浆转位;4.丹参多酚酸B能够通过促进IGFBP3启动子区域甲基化以降低IGFBP3的活性;5.丹参多酚酸B通过增强p-AKT及p-ERK信号通路调控IGFBP3从而改善糖尿病心肌病血管生成。研究背景脑血管病在全球范围内具有前三位的致死性和首位的致残性,其中缺血性脑卒中占卒中事件的87%,对人们的健康带来严重危害。脑组织供血中断后,血流低灌注,微血管损伤,血脑屏障破坏,引起神经元坏死、凋亡。梗死周围半暗带区域因为仍存有部分未死亡的脑组织,被认为是减轻脑梗死损伤的治疗靶标,而改善微血管损伤增加血运以恢复血氧供应是长期以来治疗缺血性脑梗死的有效治疗方法。丹参多酚酸B(Salvianolic Acid B,Sal B)是中药丹参的主要化学成分之一。传统中医学认为,丹参具有活血化瘀的功效,常用于治疗心脑血管疾病。而现代研究发现,丹参多酚酸B可以减轻缺血再灌注导致的心肌损伤,其作用可能是通过改善微循环障碍,促进血管生成有关。丹参多酚酸B可以增加内皮细胞数量,促进内皮细胞管状结构生成,增加血管生成因子VEGFA、VEGFR2、ANGPT1、ANGPT2、Tie2等的表达。我们的前期研究也发现,丹参多酚酸B通过降低内皮细胞IGFBP3的表达,促进心肌血管生成从而改善糖尿病心肌病心脏功能。另外,研究发现丹参多酚酸B可以降低脑梗死模型动物的脑梗死体积和神经功能缺损评分,其作用是通过促进血管生成实现。因此,本研究中利用缺血性脑卒中大鼠为实验模型,探究丹参多酚酸B通过促进血管生成从而改善缺血性脑卒中大鼠神经功能的分子机制,以期提供可供选择的、安全的临床药物。研究目的1.研究丹参多酚酸B对缺血性脑卒中大鼠神经损伤的作用;2.研究丹参多酚酸B促进缺血性脑卒中大鼠血管生成的作用及机制;3.研究丹参多酚酸B对STC1表达的影响及其机制。研究方法1.动物模型建立及丹参多酚酸体内给药购买230g左右雄性SD大鼠,适应性喂养后采用Longa线栓法创建缺血性脑卒中(pMCAO)大鼠模型。造模方法为:麻醉后大鼠仰卧位固定,颈部消毒后正中切口,右侧颈总动脉钝性游离,分离出颈内、外动脉,结扎颈总动脉近心端及颈外动脉,随后血管夹夹闭颈内动脉,可见结扎段内血管充盈,在靠近颈总动脉结扎处用注射器扎一小口,从该口处插入线栓并沿颈总动脉插入颈内动脉,在颈内动脉内深度约2cm后结扎固定线栓,随后将皮肤缝合并充分消毒,腹腔注射4ml生理盐水补充体液耗损,放置于保温毯上,栓塞2h后将线栓拔出约1cm,剪除外漏线栓。将造模成功的大鼠随机分为3组:缺血性脑卒中大鼠模型组(OG)、丹参多酚酸B低剂量组(10mg/kg/d)(SalB-L)、丹参多酚酸B高剂量组(20mg/kg/d)(Sal B-H)。假手术组大鼠(Sham)动脉血管内不插入线栓,其余手术操作过程完全相同。造模成功后,丹参多酚酸B高、低剂量组大鼠开始以腹腔注射方式给予相应浓度的丹参多酚酸B,每日1次,假手术组及缺血性脑卒中模型组大鼠腹腔注射等量的生理盐水。2.神经功能评定大鼠取材前,大鼠的神经功能缺损情况利用Longa5分制标准法检测。3.蛋白免疫印迹剪取各组大鼠梗死区脑组织,经蛋白提取、凝胶电泳、转膜后,检测相关蛋白在组间的差异性表达。4.梗死体积评定过量麻醉大鼠,迅速断头取脑,脑组织冠状面切片,2%的2,3,5氯化三苯基四氮唑染液(TTC)检测各层脑组织缺血梗死情况。5.组织学染色收集各组大鼠脑组织,用4%多聚甲醛固定,经标准步骤脱水制备石蜡切片,进行H&E染色观察神经元损伤情况,进行Nissl染色观察尼氏小体损伤情况。6.组织荧光免疫组化收集各组大鼠脑组织,4%多聚甲醛固定24h后梯度蔗糖溶液沉糖脱水,OCT包埋后冰冻切片机切片。应用免疫组织荧光染色,观察脑组织内神经元损伤情况、毛细血管密度及STC1表达情况。7.TUNEL 染色各组大鼠脑组织冰冻切片进行TUNEL染色以观察神经元凋亡情况。8.提取原代皮层神经元购买新生24h内大乳鼠,断头取脑后提取原代皮质神经元,鉴定后检测丹参多酚酸B的含药血清对神经元凋亡的影响。9.主动脉环出芽实验剪取大鼠胸主动脉环,给予Matrigel基质胶培养,观察各组含药血清对主动脉环出芽情况的影响。10.细胞培养购买HUVECs,常规方法换液、传代及冻存。11.基因表达的干预在体外实验中,利用瞬时转染siRNA-STC1的方式抑制细胞STC1的表达。12.体外成管实验检测HUVECs分为对照组、乏氧组、乏氧加Sal B组、乏氧加抑制STC1表达组、乏氧加丹参多酚酸B加抑制STC1表达组。将基质胶预先在4℃条件下过夜融化,第二天铺板,预冷的吸头吸取70ul基质胶到24孔板中,置于37℃孵箱中孵育30min,待其成胶。将经历不同的刺激之后的各组细胞,取200ul各组细胞悬液(密度:4*104/ml)铺到胶上。4小时后,观察计算细胞管状结构长度及数量。13.细胞的迁移实验利用划痕实验及Transwell小室观察丹参多酚酸B对内皮细胞迁移能力的影响。14.细胞的增殖实验利用Edu增殖实验观察丹参多酚酸B对内皮细胞增殖能力的影响。15.统计学分析所有实验结果均应用SPSS 18.0软件统计分析,且以平均数±标准差表示。多组间的变量运用单因素方差分析检验,P小于0.05认为有统计学意义。研究结果1.丹参多酚酸B促进缺血性脑梗死大鼠脑组织血管生成缺血性脑梗死大鼠造模成功后,给予单身多酚酸B腹腔注射给药,提取各组大鼠脑组织蛋白,western blot结果显示相较于丹参多酚酸B给药2w,丹参多酚酸B给药2w更能促进VEGFR2、VEGFA蛋白的表达,故采用丹参多酚酸B给药3周用于随后的实验。2.丹参多酚酸B能够减轻缺血性脑卒中大鼠神经功能损伤高、低剂量的丹参多酚酸B给药3周后,Longa5分标准法评定结果显示,丹参多酚酸B能够降低神经功能损伤评分。3.丹参多酚酸B能够减轻缺血性脑卒中大鼠梗死体积TTC染色结果发现,丹参多酚酸B可以减轻梗死体积。4.丹参多酚酸B能够减轻缺血性脑卒中大鼠脑组织损伤H&E染色剂Nissl染色结果发现,丹参多酚酸B可以减轻脑损伤。Cleaved-caspase3的免疫组织化学染色结果及TUNEL染色结果显示,模型组大鼠梗死区神经元凋亡明显,给予丹参多酚酸B治疗后,凋亡的神经元明显减少。脑组织梗死区的Western blot检测结果显示,凋亡相关蛋白的表达在模型组升高,丹参多酚酸B治疗后表达降低。进一步的原代神经元细胞培养后,乏氧刺激后,给予各实验组大鼠血清继续培养,TUNEL染色及western blot检测结果均表明,丹参多酚酸B能够减轻原代神经元的凋亡。5.丹参多酚酸B能够促进缺血性脑卒中大鼠脑组织血管生成CD31的免疫组织化学染色结果显示,与假手术组大鼠相比,缺血性脑卒中组大鼠CD31蛋白表达显著减少,高、低剂量的丹参多酚酸B干预后,缺血性脑卒中大鼠脑组织中CD31表达增加。主动脉环出芽实验显示,乏氧条件下的主动脉环出芽减少,给予丹参多酚酸B含药血清培养后,主动脉环出芽增多,进一步表明丹参多酚酸B促进血管生成。6.丹参多酚酸B通过促进STC1表达促进血管生成大鼠脑组织STC1的免疫组化结果显示,假手术组大鼠脑组织中几乎不表达STC1,缺血性脑卒中大鼠STC1表达增多,而高、低剂量的丹参多酚酸B治疗进一步提高STC1的表达。体内外的western blot检测结果进一步显示,丹参多酚酸B治疗可以增加乏氧依赖性的STC1的表达。7.抑制STC1的表达可抑制人脐静脉内皮细胞的迁移丹参多酚酸B可以促进乏氧条件下人脐静脉内皮细胞的迁移作用,转染si-RNA抑制STC1的表达后,丹参多酚酸B对细胞迁移的促进作用降低。8.丹参多酚酸B通过激活mTOR/AKT信号通路促进血管生成各组大鼠脑组织免疫印迹实验结果表明,高、低剂量的丹参多酚酸B治疗组大鼠脑组织中AKT及ERK信号通路的磷酸化水平升高。研究结论1.丹参多酚酸B能够提高缺血性脑卒中大鼠神经功能缺损评分及脑梗死体积;2.丹参多酚酸B能够通过促进脑组织血管生成进而减轻缺血性脑卒中大鼠神经元凋亡;3.丹参多酚酸B通过提高STC1活性促进缺血性脑卒中大鼠脑组织血管生成;4.丹参多酚酸B可能通过激活mTOR/AKT信号通路促进缺血性脑卒中大鼠血管生成。