【摘 要】
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细菌性疾病是海水养殖鱼类最主要的一类疾病,但鉴定病原所需的传统微生物学方法常常受到场地和时间的限制,近年来,分子生物学技术发展迅速,由此衍生的分子诊断方案具有更强的特异性和敏感性,也是目前快速检测病原行之有效的方法。本研究以轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae)为对象,依次建立了这
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细菌性疾病是海水养殖鱼类最主要的一类疾病,但鉴定病原所需的传统微生物学方法常常受到场地和时间的限制,近年来,分子生物学技术发展迅速,由此衍生的分子诊断方案具有更强的特异性和敏感性,也是目前快速检测病原行之有效的方法。本研究以轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae)为对象,依次建立了这两种病原菌的微流控荧光定量PCR和重组酶聚合酶扩增(RPA)检测方法。主要研究结果如下:1.基于tox R基因的轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)微流控荧光定量PCR检测方法的建立以轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)的单拷贝tox R基因的高保守区域为目的片段,设计特异性引物,构建重组质粒标准品,建立针对该菌的荧光定量PCR检测方法。以此为基础,选用UF-150 Genechecker微流控荧光定量PCR仪,通过优化反应体系和反应条件,建立了轮虫弧菌的微流控荧光定量PCR检测方法。该方法能特异性扩增tox R基因目的片段,对轮虫弧菌纯培养物检测下限为1.34×10~0 copies/μL。在人工感染样品中的应用结果表明:对鱼体组织中轮虫弧菌的检测下限为1.34×10~3cfu/g,检测结果可以目视判读,检测时间缩短至42 min以内。该检测方法具有特异性强、敏感度高、场地要求低等突出优势,适于开发水产病原实用性的现场快速检测技术。2.基于Mcp基因和Dly基因的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae)致病性菌株微流控荧光定量检测技术的建立以美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae)的单拷贝Mcp基因的高保守区域为目的片段,设计特异性引物,构建重组质粒标准品,建立针对该菌的荧光定量PCR检测方法。同时以美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的毒力基因Dly为基础,成功区分美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(P.damselae subsp.damselae)的强致病性和弱致病性菌株。以此为基础,选用UF-150 Genechecker微流控荧光定量PCR仪,通过优化反应体系和反应条件,建立了美人鱼发光杆菌美人鱼亚种强致病性菌株的微流控荧光定量PCR检测方法。该方法能同步特异性扩增Mcp基因和Dly基因目的片段,对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的纯培养物的检测下限为1.0×10~1copies/μL。在人工感染样品中的应用结果表明:对鱼体组织中美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的检测下限为1.0×10~3 cfu/g,检测结果可以目视判读,检测时间缩短至23 min以内。该方法具有特异性强、灵敏度高、场地要求低等突出优势,适合开发水产病原实用性的现场快速检测技术。3.基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)快速检测轮虫弧菌和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种分别以轮虫弧菌(V.rotiferianus)的单拷贝tox R基因和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(P.damselae subsp.damselae)的单拷贝Mcp基因为检测靶标,分别建立基于tox R基因的轮虫弧菌RPA检测技术和基于Mcp基因的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种RPA检测技术,并分析了该方法的灵敏性、特异性和稳定性,评判了该技术应用于现场检测的可能性。结果表明:基于RPA的检测方法灵敏度较高,但相比微流控荧光定量PCR的检测方法略低。成功构建的轮虫弧菌tox R基因和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种Mcp基因的RPA引物特异性强,未发现与非目的菌株如哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)等发生非特异性反应。本研究证明,该方法能够替代RT-PCR技术,应用于现场检测技术的研发。
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