第一部分HSV-2感染VK2细胞不同时间点Toll样受体信号通路的变化【目的】为建立良好的体外HSV-2感染VK2/E6E7细胞的模型以利后续实验,需探索出一种简便稳定快速,可扩增出大量满足毒力需求的HSV-2的方法。并在此基础上研究HSV-2感染VK2/E6E7模型不同时间点TRLs信号通路各关键蛋白分子及终末免疫因子的变化,为进一步探讨中药复方洁泽1号基于天然免疫TRLs信号通路抗HSV-2的作用机制奠定基础。【方法】首先采用以Vero细胞为宿主常规培养法、以VK2/E6E7细胞为宿主连续复壮法和以Vero细胞为宿主浓缩扩增体系法三种方法来扩增病毒,以Reed-Muench法测定每种方法所扩增HSV-2的TCID50和以MTT法测定每种方法所扩增HSV-2感染VK2/E6E7细胞的存活率,来评价其是否达到建模成功的标准、毒力高低、稳定程度和扩增效率。分别在病毒感染细胞的0、2、4、6、12、18和24小时,采用MTT法测定细胞存活率,流式凋亡法检测细胞凋亡率,Western Blot法检测TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9、g D、HVEM、My D88、TRIF、IΚBα、P-IΚBα、IRF3、P-IRF3、IRF7和P-IRF7蛋白表达水平,免疫荧光法检测g D病毒蛋白表达和NF-ΚB入核表达情况,用核蛋白提取试剂盒分离核蛋白和浆蛋白,Western Blot法检测上述不同时间点总蛋白、核蛋白和浆蛋白中NF-ΚB表达情况,Elisa方法检测IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、IFN-α和IFN-β的浓度。【结果】以Vero细胞为宿主常规法、以VK2/E6E7细胞为宿主连续复壮法和以Vero细胞为宿主浓缩法三种方法所扩增病毒的TCID50分别为10-7.16、10-9.45和10-12.5,而其稀释5倍存活率分别为75.74%±9.66%、49.7%±2.51%和28.31%±2.58%。病毒感染细胞后的0、2、4、6、12、18和24h,细胞存活率逐渐下降,在24h最低,细胞凋亡率逐渐上升,在24h最高。免疫荧光显示g D病毒蛋白表达在胞膜,从12h开始见其荧光表达,而NF-KB在感染后2、4、6h荧光表达在胞浆,从12h入核的荧光表达逐渐增多,两者均在24h荧光表达最多。TLR3、TLR4、TLR7、TLR9、g D、TRIF、P-IΚBα、P-IRF3蛋白和NF-KB核蛋白在病毒感染后12h、18h、24h的表达水平极显著增高,24h最高。TLR2、P-IRF7蛋白和NF-KB浆蛋白在病毒感染后6h、12h、18h、24h的表达水平极显著下降,24h最低。My D88在病毒感染后6h、12h、18h表达水平显著升高,12h最高。总蛋白NF-KB、IΚBα、IRF3、IRF7和HVEM在病毒感染后不同时间点无明显变化。IL-6浓度在病毒感染后4h达高峰,IL-8浓度在18h达高峰,IL-1β浓度在6h达高峰,TNF-α和IFN-β浓度在24h达高峰,而IFN-α浓度在病毒感染后逐渐下降,在24h达最低峰。【结论】三种方法中以Vero为宿主浓缩法所扩增病毒毒力最强。HSV-2感染VK2细胞后,随着时间的延长细胞存活率逐渐下降而凋亡率逐渐上升。Toll样受体信号通路中的关键蛋白和终末免疫因子在HSV-2感染细胞后的不同时间点表达水平不一样,各蛋白和因子均有其对应的关键时间点。第二部分基于Toll样受体信号通路探讨体外洁泽1号抗HSV-2药效机制【目的】基于HSV-2感染VK2/E6E7模型不同时间点TLRs信号通路各关键蛋白和效应分子的变化特征,选择最佳观察与切入时机,研究中药复方洁泽1号对TLRs信号通路的影响及其体外抗HSV-2的作用机制,以期阐明洁泽1号抗HSV-2部分作用机制,为丰富中药复方抗疱疹病毒的科学内涵提供实验依据。【方法】首先以MTT法检测阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦7个药物浓度的细胞存活率以确定各自的最低细胞毒细胞毒作用浓度,将7个药物浓度的阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦与病毒共孵育24h,观察细胞形态的改变,用MTT法检测细胞存活率,比较后可得出最佳抗HSV-2作用浓度。按照上述方法同样可测定小檗碱和洁泽1号的最低细胞毒细胞毒和最佳抗HSV-2作用浓度。流式凋亡法检测喷昔洛韦、小檗碱和洁泽1号干预后的细胞凋亡率,Western Blot法检测三种药物干预后TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9、g D、HVEM、My D88、TRIF、IΚBα、P-IΚBα、IRF3、P-IRF3、IRF7和P-IRF7蛋白表达水平,免疫荧光法检测三种药物干预后g D病毒蛋白表达和NF-ΚB入核表达情况,用核蛋白提取试剂盒分离核蛋白和浆蛋白,Western Blot法检测上述不同时间点总蛋白、核蛋白和浆蛋白中NF-ΚB表达情况。Elisa方法检测IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α、IFN-α和IFN-β的浓度。【结果】阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦均从1.25mg/ml开始均无明显细胞毒作用。阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦的最佳抗病毒作用浓度分别为0.078125mg/ml、0.15625mg/ml和0.078125mg/ml,最高细胞存活率分别为62.07%±1.17%、76.63%±5.39%、87.46%±5.49%。洁泽1号、小檗碱和喷昔洛韦干预后,细胞凋亡率均较病毒组明显下降,但小檗碱组凋亡率仍较高。喷昔洛韦和洁泽1号干预后NF-KB无明显入核荧光,g D荧光表达显著降低,且洁泽1号接近正常水平。而小檗碱干预后入核荧光明显减少,但g D荧光表达仍较多。三种药物干预后,TLR3、TLR4、TLR7、TLR9、g D、My D88、TRIF、P-IΚBα、P-IRF3蛋白以及核蛋白NF-KB表达水平显著下降,TLR2、P-IRF7和浆蛋白NF-KB表达水平显著升高,总蛋白NF-KB、IΚBα、IRF3和IRF7的表达水平无明显变化。IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-β的浓度在三种药物干预后均较病毒组显著下降,而IL-8浓度在喷昔洛韦和洁泽1号干预后较病毒组明显降低,IFN-α浓度在小檗碱和洁泽1号干预后较病毒组显著升高。【结论】阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦三个药物中最佳的阳性对照药物为喷昔洛韦,洁泽1号与喷昔洛韦、小檗碱相比抗HSV-2作用最佳,其抗HSV-2的作用机制可能和调控TLRs信号通路相关,并通过促进干扰素的分泌且下调炎性因子发挥抗病毒作用。第三部分HSV-2感染小鼠模型的构建【目的】再造并优化HSV-2感染小鼠模型,建立模型评价体系,为研究药物体内抗生殖器疱疹病毒药效和作用机制奠定基础。【方法】所有小鼠先肌注黄体酮5天,然后将小鼠分为阴道物理摩擦组和无物理刺激组,再通过直接注入法、黏膜下注射法和海绵凝胶法向物理刺激过和无物理刺激的小鼠阴道内接种TCID50分别为10-10、10-9、10-8、10-7、10-6和10-5的病毒液,造模后,每日观察小鼠的外阴及全身症状、体重变化,按照评分标准进行症状评分,记录小鼠死亡状况,计算造模成功率和死亡率。造模成功后第1、3、7、10、14、17、21天对小鼠进行称重,取小鼠阴道分泌物通过TCID50法计算其病毒毒力,并在相应的天数取血和阴道组织。【结果】当小鼠阴道未进行物理刺激时,三种病毒接种方式方式在六个病毒滴度下均无法造模成功,当小鼠阴道物理摩擦后,三种病毒接种方式在10-8、10-9、10-10的病毒滴度下均可造模成功,但成功率和死亡率不一样。当病毒TCID50为10-10时,三种病毒接种方式造模成功率和死亡率均较高,病毒TCID50为10-8时,三种病毒接种方式死亡率均较低,而直接注入法造模成功率较高,另两种方法造模成功率较低。选用直接注入法造模后,在10-5到10-10六个病毒滴度中,只有病毒TCID50为10-8时造模成功率高,死亡率低。当小鼠体重波动在18g-30g之间时,造模成功率和死亡率均随着体重的上升而下降。当病毒液体积为10ul、15ul和20ul时,造模成功率随着病毒液体积的下降而下降。造模成功后,其症状评分和阴道分泌毒力在造模后第7-12天上升幅度最高,而存活率在造模后第7-12天下降幅度最大,小鼠体重在这个天数区间内最低。【结论】物理刺激小鼠阴道是造模成功的关键环节,同时病毒毒力、接种病毒方式、病毒液体积和小鼠体重与造模的结局和密切相关,造模成功后,在第7-12天期间小鼠病毒感染症状进展最为严重。第四部分洁泽1号凝胶抗HSV-2感染小鼠药效初探【目的】在HSV-2病毒感染小鼠模型基础上,比较院内制剂工艺(临床用)和精制工艺制剂(体外实验用)低、中、高和特高剂量组洁泽1号凝胶抗HSV-2药效,初步探索体内洁泽1号是否具有抗HSV-2病毒感染的作用,并比较两种制剂工艺的药效差别。【方法】首先将院内制剂和精提制剂的洁泽1号分别制成浓度为2g/l(特高剂量)、1.5g/l(高剂量)、1g/l(中剂量)和0.5g/l(低剂量)的凝胶,将阿昔洛韦制成3%的凝胶,喷昔洛韦制成1%的凝胶,小檗碱制成0.03%凝胶,并用双蒸水制成空白凝胶。所有小鼠肌注黄体酮5天后,先对阴道进行物理摩擦,再加入20ul病毒液,然后模型组小鼠注入20ul空白凝胶,其他各药物组小鼠注入相对应浓度的药物凝胶20ul。造模后每天观察小鼠的死亡率和外阴症状,并进行症状评分,每隔3天对小鼠进行称重和测定阴道分泌物毒力,在造模后第21天处死小鼠,取血和阴道组织。【结果】造模成功后,模型组小鼠存活率、阴道分泌物毒力和体重均显著下降,与正常组相比有统计学差异,而症状评分明显升高。洁泽1号院内制剂特高、高剂量组和洁泽1号精提制剂组存活率与病毒组相比显著性升高。洁泽1号院内制剂和精提制剂的特高、高、中剂量组和喷昔洛韦、小檗碱组小鼠的阴道分泌物毒力较病毒组相比显著性下降。洁泽1号院内制剂特高、高、中剂量组和精提制剂的特高、高剂量组以及喷昔洛韦、小檗碱组的小鼠体重较病毒组明显上升。洁泽1号院内制剂和精提制剂组小鼠的症状评分随着剂量的升高而降低,小檗碱组的症状评分要低于喷昔洛韦和阿昔洛韦组,所有药物中,洁泽1号院内制剂特高剂量组症状评分最低。【结论】在药物干预抗小鼠HSV-2病毒感染的实验中,洁泽1号院内制剂凝胶药效要优于洁泽1号精提制剂凝胶,喷昔洛韦和小檗碱药效要优于阿昔洛韦,而在所有药物中,以洁泽1号院内制剂特高剂量组凝胶药效最佳。