研究背景:癫痫是神经内科常见的疾病,是由于一侧或两侧大脑半球神经元异常同步放电引起的短暂性脑功能障碍,尽管不断有新的抗癫痫药(antiepileptic drugs,AEDs)投入临床应用,但仍有大约20%-30%的患者发展为难治性癫痫(refractory epilepsy,RE)。目前有关难治性癫痫耐药性的机制尚不十分清楚。有研究显示血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)血管内皮细胞膜上存在多种药物外向转运体,这些转运体构成BBB的另一道屏障,与癫痫的多药耐药性相关[9]。多药转运体是一些能与药物结合并能将其转运出细胞的蛋白,包括三磷酸腺苷结合盒(ABC)超家族成员如磷酸糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白、乳腺癌抗药蛋白、大脑多药抗药蛋白和Ras超家族成员RL-IP76。生理条件下多药转运体作为外排泵,能够主动将药物泵出到血脑屏障以外,从而保护脑实质。因此多药转运体的表达和脑组织内药物浓度降低成正比[10],P-gp是首先被发现的多药耐药蛋白质,它由多药耐药基因(multidrug resistant gene,MDR)编码,病理情况下如癫痫发作的强度、时程、长期服用抗癫痫药等都可以使P-gp表达上调,限制癫痫药物进入脑组织,使患者脑内抗癫痫药物浓度下降,这可能参与了难治性癫痫多药耐药的发生。因而改善耐药性癫痫预后的方法就是针对耐药性癫痫P-gp的过度表达,避免P-gp的外排作用、加强抗癫痫药物的作用。目前有许多抑制P-gp的药物逐渐被证实,包括钙通道阻滞剂、激素、蛋白激酶C抑制剂、免疫抑制剂、抗生素、表面活性剂等。但是这些研究多集中在对P-gp功能的影响,鉴于此,本课题拟建立慢性癫痫模型,给予P-gp抑制剂联合常规抗癫痫药物,研究P-gp抑制剂对难治性癫痫脑组织P-gp表达的影响,探讨P-gp抑制剂的价值,为临床难治性癫痫的治疗提供新的方向。目的建立氯化锂-匹罗卡品慢性癫痫模型,观察P-gp抑制剂维拉帕米对难治性癫痫大鼠的脑电图、自发性癫痫的发作频率和程度、大脑皮层及海马组织P-gp表达的影响。方法(1)建立氯化锂-匹罗卡品慢性癫痫模型:雄性wistar大鼠50只,安装大脑皮层电极,两周之后,给予氯化锂-匹罗卡品,诱发大鼠癫痫持续状态,终止发作后存活且状态良好的大鼠出现自发性癫痫视为造模成功。(2)将造模成功的大鼠,经过耐药性选择后,分为生理盐水组、匹罗卡品组、卡马西平组、低剂量维拉帕米组、高剂量维拉帕米五个组。分别给予相应的药物,观察各组大鼠自发性癫痫的发作次数与发作级别,并记录各组大鼠在不同时期的脑电图,取包括海马在内的脑块,通过免疫组化染色,图像分析各组P-gp表达阳性面积率,半定量测定大鼠海马组织及皮层P-gp的表达程度。结果(1)造模过程中,除生理盐水组的6只大鼠之外,其余44只大鼠均诱发出癫痫持续状态,存活且状态良好者38只,出现自发性癫痫者32只。造模成功率为72.73%,行为学上表现为:出现以口咽自动症为主的复杂部分发作,发展为强直阵挛发作,癫痫持续状态一小时后给与安定中止发作;两天后进入静止期,两周左右发展为反复自发发作。(2)慢性期卡马西平组大鼠的自发性癫痫发作次数发作程度与匹罗卡品组比较无明显差别(P>0.05),两个维拉帕米组与前两组比较大鼠的发作频率明显减少(P<0.05),发作程度明显减轻(P<0.05)。两个维拉帕米剂量组之间比较差异没有统计学意义(P>0.05)。脑电图示:匹罗卡品组、卡马西平组出现阵发的多棘波,后者较前者波幅压低,维拉帕米组散在出现单个棘波或尖波,且波幅明显降低。(3)P-gp的表达结果:海马P-gp的表达较皮层多(P<0.05),各组之间比较:与生理盐水组相比,其他四组的P-gp的表达均增强,且四组之间阳性面积率从高到低依次是且卡马西平组、模型组、两个维拉帕米组,它们之间均有明显差异(P<0.05),而维拉帕米两个剂量组之间无明显差异(P>0.05)。结论(1)本实验建立的匹罗卡品癫痫模型复制了人类颞叶癫痫复杂部分发作基本特征,是进行难治性癫痫研究的一个较为理想的动物模型。(2)维拉帕米可以抑制大鼠的痫性放电,明显的减少自发性癫痫的发作频率,减轻发作程度。(3)维拉帕米可以抑制P-gp的功能,降低难治性癫痫大鼠脑内P-gp表达量。