热性惊厥(febrileseizures,FS)是人类最为常见的小儿时期惊厥发作性疾病。随着研究的深入发现,FS大多具有一定家族遗传性,部分FS患儿是癫痫发生的高危人群,随后可发展为多种表型的严重程度不一、持续性的无热性癫痫,1997年,Scheffer等率先报道全面性癫痫伴热性惊厥附加症(GEFS+)。GEFS+是以家族作为整体进行诊断的癫痫综合征,在同一个家系内,家系成员的临床发作谱可由多种表型和多种发作形式组成。然而,越来越多的研究表明,在一些家系的成员临床发作谱中,全面性发作和部分性发作可以同时并存,因而GEFS+的命名受到了一定挑战。为了涵盖更多与FS相关的遗传性癫痫,遗传性癫痫伴热性惊厥附加症(GEFS+)是从全面性癫痫伴热性惊厥附加症衍生扩大而来的概念,更好地解决了过去一些与FS有关综合征的命名混乱问题。目前遗传性癫痫伴热性惊厥附加症的命名已获普遍认可,GEFS+家系共同特点是均有热性惊厥发作的家族史,但家系成员伴随的其他癫痫发作类型则各有不同,从简单到复杂、轻微到严重。与其他的癫痫综合征不同的是,GEFS+的诊断并非局限于个体,其诊断是基于家系中多个成员的临床表型属于GEFS+表型谱,其中最常见的表型为典型热性惊厥(FS,febrile seizure),其次是热性惊厥附加症(FS+,febrile seizures plus),其他临床表型包括FS/FS+伴其他全身性发作,例如FS/FS+伴肌阵挛性发作、FS/FS+伴失神发作、FS/FS+伴失张力发作,以及FS/FS+伴部分性发作。最严重和少见的表型为癫痫性脑病,包括肌阵挛站立不能性癫痫和婴儿严重肌阵挛性癫痫等难治性癫痫,或者其他特发性全身性癫痫等表型。随着众多GEFS+家系的不断被分析报道,越来越多的新临床表型逐渐被认识和完善。GEFS+发病机制复杂,遗传因素及相应的分子改变对引起脑神经元异常过度放电具有重要作用,同时也是由遗传因素和环境因素共同作用的结果。分子生物学的发展为本病的遗传学研究奠定了良好基础,人们相继找寻到多个候选致病基因,一定程度揭示了热性惊厥疾病的奥秘,也积累了丰富的资料从而不断加深对本病的认识。近十余年的国际研究已表明,大多数的家系分析显示GEFS+家系为常染色体显性遗传并伴不完全外显,外显率约为50%-89%,由于外显率不完全而致家系内成员的临床表型轻重不一。GEFS+发病与五种离子通道基因突变相关,包括编码钠离子通道亚基基因(SCN1A、SCN2A、SCNIB);以及编码氯离子通道的GABAA受体亚基基因(GABRG2、GABRD)等存在突变有关。1998年Wallaee等首先在GEFS+患者获证实存在SCNIB基因突变,2000年Escayg等随后在GEFS+家系发现SCNIA基因的错义突变,2001年Sugawar等和Baulac等分别发现SCN2A、GABRG2基因存在错义突变,2004年Dibbens等发现GABRD基因与GEFS+有关。其中以编码钠离子通道α1亚基的SCNIA基因突变最为常见,与热性惊厥关系最为密切。目前国际上虽已见大量GEFS+家系被研究报道,但发现存在基因突变的家系比例尚不足全部GEFS+家系的20%。大部分GEFS+家系的基因型仍不清楚,发病机制尚未阐明。近年来国内虽陆续有GEFS+家系报道,然而,仅在个别家系中发现了少数SCNIA及GABRG2基因突变,目前仍未见其余基因突变的相关报道。由此可见,GEFS+与遗传因素密切相关,同时存在种族及地域的人群遗传背景差异性,具有明显遗传异质性。因此,我国尚缺乏对大样本家系的致病基因遗传分析,GEFS+基因型与临床表型关系的研究亟待完成。同时,我们迫切需要借助新一代测序技术以高效地探寻出我国人群背景GEFS+家系的新致病基因,不仅有助于揭示该病的发病机制,也为该病的诊治提供新的方法。全基因组外显子测序技术是自近年新兴成熟的一种基因组研究方法,其利用序列捕获技术将所探测到的位于全基因组外显子区域DNA信息捕捉和富集后,运用高通量测序的基因组分析方法。该技术可探查出所在外显子组序列区内绝大多数的疾病相关性基因变异、常见基因变异甚至一些低频突变。运用全外显子组测序技术成为鉴定孟德尔疾病致病基因的一种全新的高效策略,具有所需样本量少、低费用及高通量的优势和特点,渐渐为研究者们所了解并应用。本研究拟在完成收集23个GEFS+家系样本资料的基础上,对家系受累成员选取已知SCN1A、SCN2A、SCN1B、GABRG2及GABRD基因完成全部外显子区筛查,了解是否存在同样的遗传背景。并进一步选取未能发现已知基因突变的家系拟应用全外显子组测序方法进行外显子序列扫描结合生物信息分析技术,以期捕获并鉴定出中国人群背景的GEFS+新病基因,探讨GEFS+的发病原因与机制,进而为GEFS+早期诊断、治疗及新药物开发提供理论依据及治疗新靶点。[对象和方法]1.对象：收集2011年～2014年于广东省人民医院确诊的23个GEFS+家系,选取200例健康人群为正常对照组。研究获得广东省人民医院伦理委员会批准,所有家系成员研究对象或其法定监护人均需签署知情同意书。健康对照组无相关疾病家族史,无神经系统疾病的症状和体征。2.临床资料：本研究对所有先证者及其家系其他生存受累成员临床表现、脑电图和头颅MRI影像学等临床资料进行总结分析。根据2010年国际抗癫痫联盟(ILAE)的癫痫发作和癫痫综合征分类标准对家系成员临床表型进行诊断。3.已知致病基因突变筛查：(1)采集GEFS+家系成员118例(包括发病人数96人)和健康对照人群200例的外周静脉血样5mL,提取基因组DNA。(2)应用PCR产物Sanger测序技术对所有家系先证者完成已知致病基因(SCN1A, SCN2A, SCN1B, GABRG2, GABRD)所有外显子区的扩增筛查。从NCBI数据库查找出目的基因的cDNAJ序列,然后在UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu/)获取基因组全序列,运用Primer 3.0软件设计PCR扩增引物。PCR反应扩增目的基因的所有外显子序列及剪切位点序列。(3)纯化PCR产物后应用ABI3730测序仪进行测序。测序结果通过与GenBank中的标准序列比对查找碱基改变。若发现可疑突变位点,随后扩增200例健康对照组的相应基因片断进行比对,以除外基因的多态性并确定新发现的突变点,同时对其家族成员进行突变筛查验证。4、全基因组外显子测序探寻家系新致病基因(1) GEFS+家系新致病基因候选基因位点的捕获在前期排查已知致病基因突变结果阴性的GEFS+家系中,选取一个家系D的2个受累患者及2个表型正常成员的样本,外送华大基因深圳公司通过高通量的测序平台进行全基因组外显子测序,数据结果结合生物信息分析技术,查找出GEFS+家系的候选新致病基因候选变异位点。(2)应用sanger测序法验证候选致病基因变异位点按照优先级别对候选变异位点进行排序,并根据对疾病的研究经验,优先选择家系中外送全外显子测序的2名患者样本所共有的候选基因变异位点,应用PCR Sanger测序法进行筛查,以排除假阳性位点后,选取阳性突变位点结果进行下一步验证。①家系内验证：对家系D中的7名成员患者(包括3名患者和4名未发病成员)进行验证阳性位点。因GEFS+是常染色体显性遗传病,应符合表型和基因型共分离验证标准,过滤排除掉患病个体中未携带的突变基因。排除标准为发病者未携带的突变；②正常人群中验证：用PCR测序方法在200正常个体中检验候选阳性基因位点,排除在正常个体中存在的突变和SNP。③家系外验证：GEFS+具有遗传异质性,对其余已知致病基因突变阴性的GEFS+家系选取突变基因进行sanger测序,以排查其他家系是否存在同样的突变基因位点。[结果]1.本研究里共收集23个GEFS+家系,共发病人数96人,男52例,女44例,遗传模式属于常染色体显性遗传。临床表型为FS表型42例和FS+表型31例,分别约占43.8%和32.3%。2.已知致病基因突变筛查结果：(1)在家系A和家系B(2/23,8.70%)中分别发现SCNIA基因第10和19外显子区存在新的突变位点(R500Q、C1274Y),均为杂合错义突变,均未在核心功能区域,分别位于钠离子通道α亚单位蛋白结构域D 1-2连接环处和D3的S2区域中。(2)2个SCNIA基因突变GEFS+家系的临床特点：家系A的先证者临床表型较重诊断为Dravet综合征。家系B的先证者临床表型为FS+,为全面性发作形式。家系A和B先证者的共同特点是发病年龄较早,均为生后6月内起病,他们分别携带的错义突变(R500Q、C1274Y)均非新生突变,追溯三代家系成员分析发现均为家系遗传,但父辈临床表型较轻,均为FS。(3)在家系C中发现先证者及其父亲共同携带SCN2A基因新的杂合错义突变(D1823G),此位点国内外尚未见报道,在国内尚属首次发现SCN2A突变。先证者临床表型为FS+伴失神发作,其父亲临床表型仅为FS。(4)所有家系在SCN1B、GABRG2、GABRD基因均未发现突变位点。3.全外显子测序方法家系致病基因捕获及验证结果(1)通过全基因组外显子测序技术,获得家系D中4名样本(2个家系患者和2个健康成员)的候选致病基因变异位点,包括SNPs、indels的数据集合。(2)采用PCR Sanger测序对家系D成员进行验证,包括家系中3名患者和4名未发病成员进行验证,结果发现3名患者及1名未发病成员均携带KCNAB3基因的错义突变H258R,而在其余3名未发病成员未发现,符合表型和基因型共分离标准。该突变点在200名健康对照人群对照结果为阴性,应用SIFT软件对蛋白功能预测提示为有害影响,分数为0.00。(3)在其余19个GEFS+家系先证者的验证中未能发现此KCNAB3基因突变位点。[结论]1.在23个GEFS+家系中,发现二个家系存在SCN1A基因新的错义突变位点(R500Q、C1274Y);该位点国内外未见报道。GEFS+的SCN1A基因以错义突变为主,SCN1A基因型与GEFS+I临床发作类型具有一定相关性。2.首次在一个GEFS+家系发现SCN2A基因突变,为杂合子错义突变(D1823G),此突变位点国内外尚未见报道。3.所有家系均未有发现.SCN1B、GABRG2、GABRD基因突变。4.首次在一个GEFS+家系的三代成员发现存在电压门控钾离子通道β3亚基基因KCNAB3杂合错义突变(H258R),该突变在国内外未见报道。5.推测KCNAB3基因很可能为我国人群背景GEFS+家系的新致病基因。