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随着全球糖尿病患病率的急剧上升,糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）俨然成为世界范围内终末期肾病的主要病因,增加了患者过早死亡的风险并带来沉重的经济和社会负担。肾小管上皮细胞凋亡是肾小管损伤的重要组成部分,也是引发DN的关键环节。既往研究发现高糖状态下晚期糖基化终产物（advanced glycation end products,AGEs）堆积,通过激活 PERK-ATF4-CHOP 信号通路,诱导内质网应激是造成DN肾小管上皮细胞凋亡的重要原因之一。因此,深入探索该环节特征及相应的干预措施,对了解DN发病的分子机制、寻找新的药物干预靶点具有重要意义。渴络欣胶囊（原名糖微康胶囊）是中国中医科学院首席研究员林兰教授研制的首个获批治疗糖尿病肾脏病的中药新药,具有滋补肝肾、益气养阴、活血化瘀之功效。前期已开展了大量的研究,涉及药学、药效学、临床疗效评价及机制探索,充分肯定了渴络欣胶囊治疗DN的疗效。研究表明渴络欣胶囊不仅可抑制糖尿病肾脏病患者体内AGEs的产生,还可抑制糖尿病大鼠肾皮质TIMP-1过度表达,增强MMP-9表达,定位主要在肾小管上皮细胞,促进细胞外基质降解,保护肾小管基底膜,抑制肾间质纤维化进展,对肾小管起保护作用。但是,渴络欣胶囊保护肾小管上皮细胞损伤的具体作用途径尚不清楚。基于课题组前期发现,本研究在北京市自然科学基金（7202172）的资助下深入探讨渴络欣胶囊在抑制AGEs生成后如何进一步发挥肾脏保护作用。研究目的:1.阐明渴络欣胶囊抑制AGEs生成后,通过调控PERK-ATF4-CHOP信号通路,干预DN肾小管上皮细胞凋亡的作用机制。2.证实DN“气阴两虚、瘀血阻络”的中医病机与现代研究中的“内质网应激—细胞凋亡”病理特征有关。研究方法:1.体内实验采用自发性2型糖尿病db/db小鼠模型,所有小鼠适应性喂养2周后,将db/db小鼠按随机数字表法分成4组:模型组（db/db+Vehicle）、渴络欣低剂量组（db/db+KLXL）、渴络欣高剂量组（db/db+KLXH）、缬沙坦组（db/db+Valsartan）,每组12只;另取12只db/m小鼠作为正常对照组（db/m+Vehicle）。渴络欣低、高剂量组分别予0.78g.d-1.kg-1、3.12g.d-1.kg-1渴络欣混悬液,缬沙坦组予10.40mg.d-1.kg-1混悬液,正常组、模型组给予同等体积CMC-Na溶液,每日固定时间灌胃1次,给药体积均为10ml.kg-1,连续给药12周。各组小鼠每日定时称量摄食量、饮水量,每周固定时间称重,每4周尾尖采血测血糖,并收集24h尿液记录尿量,ELISA法检测uALB,全自动生化分析仪检测Ucr,计算UAER、ACR、Ccr。给药12周后摘眼球取血,ELISA法检测血清AGEs,全自动生化分析仪检测Scr、BUN、TC、TG、LDL-C、HDL-C。称取双肾重量,计算肾脏系数,取右肾组织固定、冻存。HE、PAS、Masson染色观察肾组织形态学变化,透射电镜观察肾小管上皮细胞的超微结构,TUNEL荧光染色观察肾小管上皮细胞的凋亡情况,免疫组化检测GRP78蛋白定位表达,RT-PCR检测GRP-78 mRNA表达,Western Blot 检测 PERK、p-PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9 蛋白表达。2.体外实验（1）采用糖基化牛血清白蛋白（AGE-BSA）诱导的人肾小管上皮细胞株（HK-2）建立凋亡损伤模型,CCK-8法检测AGE-BSA对HK-2细胞活力的影响,筛选AGE-BSA诱导HK-2细胞成模的最佳浓度和时间。Hoechst 33342染色观察HK-2细胞核变化,AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测AGE-BSA对HK-2细胞凋亡的影响。（2）采用渴络欣含药血清干预AGE-BSA诱导的HK-2细胞,CCK-8法检测HK-2细胞相对存活率,筛选含药血清最佳干预浓度。Hoechst 33342染色荧光显微镜观察拍照,AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测含药血清对AGE-BSA诱导的HK-2细胞凋亡影响。采用内质网应激抑制剂4-PBA作为对照,Westem Blot、RT-PCR法检测渴络欣含药血清对HK-2细胞GRP78蛋白及mRNA表达的影响。构建 PERK-shRNA 载体,沉默 PERK 阻断 PERK-ATF4-CHOP 通路,Western Blot 检测渴络欣含药血清对 PERK、p-PERK、p-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9 蛋白表达的影响。研究结果:1.体内研究（1）渴络欣胶囊对db/db小鼠摄食量、饮水量的影响:与db/m小鼠相比,模型组db/db小鼠摄食量显著升高（P＜0.001）。与模型组db/db小鼠相比,渴络欣低、高剂量组小鼠在给药第5至第9周摄食量显著下降（P＜0.05）。在干预后期,随着疾病进展模型组小鼠摄食量减少,与各给药组之间无显著差异。与正常组db/m小鼠相比,模型组db/db小鼠饮水量显著升高（P＜0.001）。与模型组db/db小鼠相比,渴络欣干预可降低db/db小鼠饮水量,以渴络欣高剂量组在给药第3至第9周及第11、12周尤为显著（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）。（2）渴络欣胶囊对db/db小鼠体重、肾重、肾脏系数的影响:模型组db/db小鼠体重较正常组明显升高（P＜0.001）,在给药的第10周达到最高值,自第11、12周体重呈现下降趋势。与模型组相比,缬沙坦对db/db小鼠体重无明显影响,渴络欣低、高剂量组自给药第5周体重开始下降,以渴络欣高剂量组于给药的8～12周尤为显著（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）。与正常组db/m小鼠相比,模型组db/db小鼠双侧肾脏重量明显增加（P＜0.001）。与模型组db/db小鼠相比,渴络欣低、高剂量组及缬沙坦组双侧肾脏重量显著降低（P＜0.05,P＜0.01）。而在肾脏系数方面,模型组db/db小鼠较正常组db/m小鼠有升高趋势,而缬沙坦组小鼠肾脏系数较模型组显著降低（P＜0.01）。（3）渴络欣胶囊对db/db小鼠肾功能的影响:与db/m小鼠相比,模型组db/db小鼠 24h 尿量、UAER、ACR、BUN、Scr 显著升高（P＜0.001）,Ucr、Ccr 显著下降（P＜0.001）。与模型组db/db小鼠相比,渴络欣各剂量组24h尿量减少,以渴络欣高剂量组更为显著（P＜0.01,P＜0.001）,渴络欣各剂量组UAER在给药的4、8、12周均降低,以12周尤为明显（P＜0.05,P＜0.001）。渴络欣各剂量组 ACR、BUN、Scr 明显降低（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）,Ccr 明显升高（P＜0.05,P＜0.01）,Ucr有轻微升高趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）。（4）渴络欣胶囊对db/db小鼠糖脂代谢的影响:与正常组db/m小鼠相比,模型组db/db小鼠FBG、TC、TG、LDL-C水平显著升高,HDL-C水平显著降低（P＜0.001）。与模型组相比,渴络欣高、低剂量组FBG呈现下降趋势,与给药剂量成正相关,但差异均无统计学意义（P＞0.05）。渴络欣高剂量组TC、TG、LDL-C水平明显下降（P＜0.05,P＜0.001）,HDL-C水平明显升高（P＜0.01）,渴络欣低剂量组有下降趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）。（5）渴络欣胶囊对db/db小鼠肾脏组织病理学影响:HE染色显示,与正常组db/m小鼠相比,db/db小鼠局部肾小管变性、坏死、溶解,个别肾小管中可见脱落的肾小管上皮细胞。大部分肾小管管腔中、肾间质中出现中性粒细胞和中性粒细胞碎片,常见白细胞管型。PAS染色显示,db/db小鼠肾小球基底膜增厚,系膜基质增多,肾小管基底膜增厚等改变。Masson染色见肾小管基底膜及间质胶原纤维沉积显著增多,纤维化严重。透射电子显微镜观察模型组db/db小鼠肾小管上皮细胞见核膜皱缩,染色质凝聚,细胞核变形等凋亡形态学特征,TUNEL荧光染色见肾小管上皮细胞绿色荧光胞核显著增多,均表明了细胞凋亡增加。经渴络欣胶囊和缬沙坦干预12周后,db/db小鼠肾小管损伤及肾小管上皮细胞凋亡不同程度减轻。（6）渴络欣胶囊对db/db小鼠肾脏保护作用的体内机制研究:与正常组db/m小鼠相比,模型组db/db小鼠血清AGEs水平显著升高（P＜0.001）。肾组织GRP78蛋白及mRNA表达明显上调,主要存在于肾小管上皮细胞。肾组织p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Bax、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9 蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达显著下降（P＜0.001）。经渴络欣胶囊、缬沙坦干预后,db/db小鼠血清AGEs水平,肾组织GRP78的mRNA及GRP78、p-PERK、p-eIF2α、ATF4、CHOP、Bax、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9 蛋白表达显著下降（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）,Bcl-2 蛋白表达显著升高（P＜0.01,P＜0.001）。2.体外研究（1）AGE-BSA诱导HK-2细胞凋亡损伤模型的建立:CCK-8法显示,不同浓度AGE-BSA处理24h,与正常对照组相比,BSA对照组细胞活力无明显变化,AGE-BSA组HK-2细胞活力呈剂量依赖性降低,当AGE-BSA浓度为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml时HK-2细胞活力明显降低,分别较正常对照组降低 17.89%、27.59%、50.13%（P＜0.001）。同一浓度（400μg/ml）AGE-BSA干预6h、12h、24h,与正常对照组相比,BSA对照组细胞活力无明显变化,AGE-BSA组HK-2细胞活力呈时间依赖性降低,当AGE-BSA干预12h、24h后HK-2细胞活力显著下降（P＜0.01,P＜0.001）。AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果显示,与正常对照组相比,BSA对照组HK-2细胞凋亡率无显著差异（P＞0.05）;而AGE-BSA各浓度组HK-2细胞凋亡率呈剂量依赖性增加,当AGE-BSA浓度为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml时HK-2细胞凋亡率显著增加（P＜0.05,P＜0.001）。Hoechst 33342染色荧光显微镜观察见正常对照组或BSA对照组HK-2细胞的细胞核呈正常蓝色,形态较为饱满;而AGE-BSA处理组的HK-2细胞其细胞核呈致密浓染,颜色有些发白,伴核固缩、核碎裂等凋亡形态学改变,且随着干预浓度的升高凋亡加剧。（2）渴络欣含药血清干预AGE-BSA诱导HK-2细胞凋亡的体外机制研究:CCK-8法显示,与BSA对照组相比,AGE-BSA模型组HK-2细胞活力显著下降（P＜0.001）。与模型组相比,10%、20%渴络欣含药血清明显提高HK-2细胞的活力（P＜0.001）。AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果显示,AGE-BSA模型组HK-2细胞凋亡率较BSA对照组明显增加（P＜0.001）。与模型组相比,渴络欣含药血清低高剂量组HK-2细胞凋亡率明显下降（P＜0.001）。Hoechst 33342染色观察见BSA对照组HK-2细胞核完整,AGE-BSA处理组的HK-2细胞核固缩、碎裂,呈高亮荧光。不同浓度含药血清干预24h均可抑制HK-2细胞形态学改变,降低凋亡率（P＜0.001）。以4-PBA为阳性对照药,Western Blot、RT-PCR法检测GRP78的mRNA和蛋白表达,结果显示渴络欣含药血清高低剂量组及4-PBA组GRP78的mRNA及蛋白表达较AGE-BSA组明显下降（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）。选择抑制率最高的PERK-shRNA3载体,沉默PERK阻断PERK-ATF4-CHOP 通路,Western Blot 检测 p-PERK、PERK、P-eIF2α、eIF2α、ATF4、CHOP、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9 蛋白表达,结果显示渴络欣含药血清不同剂量组及PERK-RNAi组均可显著降低HK-2细胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Bax、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9蛋白表达水平（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）,升高HK-2细胞Bcl-2蛋白表达水平（P＜0.05,P＜0.001）,以渴络欣含药血清高剂量及PERK-RNAi组尤为显著。研究结论:（1）渴络欣胶囊可显著减轻db/db小鼠体重,降低蛋白尿,改善脂代谢,保护肾功能,减轻肾脏组织病理损伤,但对空腹血糖无显著影响。渴络欣对db/db小鼠的肾保护作用可能与降低AGEs的产生,抑制PERK-ATF4-CHOP通路活化介导的肾小管上皮细胞凋亡和内质网应激有关。（2）AGE-BSA以时间和剂量依赖性方式抑制HK-2细胞活力,又可促进HK-2细胞凋亡,AGE-BSA浓度400μg/ml,作用24h为其诱导HK-2细胞凋亡损伤最佳干预浓度和干预时间。（3）渴络欣胶囊含药血清显著提高AGE-BSA诱导的HK-2细胞活力,减少HK-2细胞凋亡,对关键基因PERK进行沉默后更进一步明确渴络欣胶囊减少HK-2细胞凋亡机制与抑制PERK-ATF4-CHOP信号通路的活化,减轻内质网应激有关。