第一部分硫化氢通过激活TRPV1通道和KATP通道调节十二指肠运动目的：自然界内的硫化氢(Hydrogen sulfide, H2S)是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体,但在哺乳动物体内可能是一种气体信号分子。在细胞内H2S主要以L-半胱氨酸(L-cysteine)作为底物,通过两种磷酸毗哆醛依赖的酶产生,分别是胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase, CBS)和胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE)。H2S可以在哺乳动物多个器官或组织合成并发挥生理调节作用。有研究报道H2S可以调节胃肠道运动,但是结果不尽一致并且机制尚未明确。我们的研究发现CBS和CSE表达在十二指肠的肌间神经丛神经元中,但是H2S对十二指肠的运动发挥着何种作用及其内在机制尚不清楚。本研究的目的是探究H2S对大鼠十二指肠的运动的影响及其内在机制。方法：十二指肠离体肌条张力记录将大鼠颈部脱臼予以牺牲,快速取出长约2cm的一段十二指肠,小心去除肠系膜及结缔组织,沿与十二指肠纵轴平行的方向剪开肠段,粘膜面向上展开并固定在盛有氧饱和Krebs溶液的硅胶盘中。在解剖镜下用显微器械小心撕去粘膜层和粘膜下层,沿平行纵轴方向制备十二指肠肌条(10mm×4mm)。用多通道生理记录仪记录十二指肠纵形肌肌条的张力。肌条在盛有5ml Krebs溶液的浴槽中孵育20分钟左右,待其自发收缩稳定后开始实验。平滑肌细胞分离与长度测量将上述实验中制备的十二指肠肌条剪成2mm×2mm小块并转移到1ml含有1.7-1.9mg Ⅱ型胶原酶、500-700μ g木瓜蛋白酶、1mg二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)、0.5mg胰蛋白酶抑制剂和1mg小牛血清白蛋白的无钙PSS溶液中消化20-30分钟。消化完毕后用Kraft-Bruhe溶液(KB溶液)冲洗数次,然后用尖端口径约2mm并抛光过的玻璃吸管轻轻吹打数次以制备单个平滑肌细胞的细胞悬液,分散的细胞保存在KB溶液中并置于4℃备用。在倒置显微镜下观察平滑肌细胞的形态并测量加药前后细胞的长度。免疫荧光双重和三重标记采用免疫荧光双重标记或三重标记技术对KATP通道、CBS和CSE进行定位。上述实验中制备的去掉粘膜层和粘膜下层的十二指肠标本,再在解剖镜下小心撕去环形肌层,剩余部分为纵行肌-肌间神经丛标本(longitudinal muscle myenteric plexus, LMMP)。将LMMP标本用4%的多聚甲醛溶液室温固定30分钟,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)洗3次后用3%的H202溶液室温孵育15分钟以封闭内源性过氧化物酶活性,PBS洗3次后用0.1%的Triton X-100孵育标本20分钟以增加细胞膜通透性,然后用10%的驴血清封闭1小时以去除非特异性染色。随后分别加入相应的一抗混合液在4℃孵育12-16小时。PBS洗3次后加入相应的荧光二抗混合液室温孵育2小时,75%甘油封片后在荧光共聚焦显微镜下观察并拍照。统计分析使用Chart5数据分析系统对所记录的肌条张力曲线下面积进行积分,积分的单位为g.s。加入NaHS、L-cysteine或SAM (S-adenosyl-L-methionine)前3分钟内的平均积分(总积分值除以时间)作为基础值,加药后不同时间段的平均积分为效应值。基础值与效应值的比值R作为标准化的运动积分,反应肌条运动的变化。加药前R值标准化为1。因为Carbachol主要引起消化道肌条基础张力增加,观察H2S对Carbachol诱发肌条收缩的影响时,统计指标采用肌条的基础张力,即肌条张力曲线的最低值。加入NaHS之前3分钟的平均基础张力值作为基础值,加入NaHS之后各时间点的基础张力作为效应值。效应值与基础值的差值即为肌条基础张力的变化值。加药前的变化值均标准化为0g。在分析平滑肌细胞长度的变化时,以加入NaHS之前的细胞长度(μm)作为基础值,加药后的细胞长度减去加药前的细胞长度即为细胞长度的变化值。数据用均数±标准误(mean±SEM)表示,用one-way ANOVA后Dunnett’s检验来分析多个实验组和一个对照组数据之间的差异,t test用于分析两组数据之间的差异,以P<0.05做为显著性差异界值,n代表每组中动物数或平滑肌细胞的数量。结果：1、NaHS对十二指肠纵形肌肌条自发收缩活动的影响浴槽内加入H2S的供体NaHS (0.5mM,1mM和2mM)之后,肌条呈现先兴奋后抑制的双相反应。在加入NaHS之后,肌条收缩活动立即明显增强,在1-2分钟内兴奋作用达到最高,5分钟之内恢复正常。加入NaHS (lmM)第一分钟内运动积分的R值由对照组1.01±0.03(n=6)增加到4.8±0.5(n=10,P<0.05)。短暂兴奋作用后肌条的运动出现持续时间较长的抑制,在15-30分钟左右R值达到最低点,45分钟左右时收缩活性部分恢复。浴槽中加入1mMNaHS15分钟之后,运动积分的R值由对照组0.8±0.04(n=6)下降到0.2±0.05(n=10, P<0.05)。NaHS对肌条的抑制作用呈现浓度依赖性,在第15分钟,0.5-2mM的NaHS对肌条运动具有明显的抑制作用,且随着NaHS浓度增高抑制作用增强,但当NaHS的浓度低到0.1mM时对肌条的运动没有影响。2, NaHS对Carbachol诱发的十二指肠纵行肌肌条收缩的影响Carbachol (2μM)引起肌条收缩张力迅速增高,持续时间超过20分钟。我们在加入Carbachol10分钟后再加入不同浓度的NaHS (0.05mM,0.1mM,0.2mM,0.5mM和1mM),发现NaHS迅速逆转Carbachol诱发的基础张力增加,且呈现浓度依赖性。加入不同浓度NaHS (0.2mM,0.5mM和1mM)5分钟之后,肌条收缩的基础张力分别降低了0.8±0.2g、0.9±0.2g和1.3±0.2g,均显著高于对照组(仅加Carbachol组)基础张力的改变(0.03±0.0l g,n=6)(P<0.05)。3. TRPV1通道和NK1受体在NaHS引起的短暂性兴奋中的作用TRPV1通道的拮抗剂Capsazepine (10μM)和NK1受体(P物质的受体)拮抗剂L703606(10μM)预孵育肌条都可以显著减弱NaHS (1mM)引起的肌条兴奋反应,阻断剂预孵育之后再加入NaHS,第1分钟Capsazepine+NaHS组和L703606+NaHS组的运动积分R值分别为1.7±0.2(n=10)和1.2±0.1(n=8),均显著低于DMSO+NaHS组(4.8±0.5,n=11)(P<0.05),而KATP通道拮抗剂格列苯脲(Glibenclamide, Glib,10μM)和电压敏感钠通道的拮抗剂河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX,10μM)都对NaHS (1mM)引起的肌条兴奋反应没有影响。4、KATP通道在NaHS引起的长时程抑制中的作用KATP通道拮抗剂Glib(10μM)预孵育肌条可以明显减弱NaHS (1mM)所引起的肌条收缩的长时间抑制作用。在NaHS加入后的第15分钟,运动积分的R值由对照组0.3±0.05(n=11)增加到Glib+NaHS组的0.8±0.1(n=8,P<0.05)。而Capsazepine、L703606和TTX对NaHS (1mM)引起的肌条收缩的长时间抑制作用没有影响。5、蛋白硫氢化在NaHS引起的双相反应中的作用巯基烷化剂NEM能够保护蛋白质分子中游离巯基使其不被硫氢化。肌条在含NEM(0.1mM)的Krebs液中孵育15分钟后再加入NaHS (1mM), NaHS所引起的短暂性兴奋作用明显减弱。NEM(0.1mM)孵育后加入NaHS1分钟后的运动积分R值降低到1.6±0.3(n=9),而对照组为4.6±0.4(n=13),相比有明显差异(P<0.05)。除此之外,NaHS所引起的长时间的抑制作用也被NEM部分逆转。NEM+NaHS组加入NaHS后15分钟的运动积分R值为0.5±0.1(n=9),显著高于NS+NaHS组的R值(0.2±0.05,n=13)(P<0.05)。6、KATP通道在十二指肠平滑肌细胞中的表达免疫荧光双重标记的方法显示,在分离培养的平滑肌细胞和LMMP标本上,SM22(平滑肌细胞的标记物)和Kir6.2(KATP通道的亚基)共表达在相同细胞上,这说明KATP通道表达在十二指肠平滑肌细胞上。7、NaHS对单个平滑肌细胞的直接舒张作用NaHS (0.5mM和1mM)可以引起急性分离的单个十二指肠平滑肌细胞的长度显著增加,这一作用持续5分钟以上,该作用呈现一定的浓度依赖性。加入NaHS(1mM)5分钟后,平滑肌细胞的长度增加了3±0.5μm(n=18),明显高于对照组细胞长度的改变(0.1±0.2μm)(P<0.05).NaHS(1mM)引起的平滑肌细胞的舒张作用可被KATP通道拮抗剂Glib(10μM)和巯基烷化剂NEM(0.1mM)所阻断。Glib预处理使加入NaHS(1mM)后第5分钟时细胞长度的改变由2.8±0.4μm(DMSO+NaHS组,n=13)减小到一0.2±0.3μ m(Glib+NaHS组,n=18,P<0.001)；NEM预处理使NaHS(1mM)引起的细胞长度的改变由2.9±0.5μm(PSS+NaHS组,n=18)减小到0.1±0.4u m(NEM+NaHS组,n=12,P<0.001)8、CBS和CSE在十二指肠肌间神经丛的表达免疫荧光三重标记和免疫荧光双重标记的结果显示,CBS和CSE表达在十二指肌间神经丛内NeuN阳性的神经元上,而平滑肌细胞上没有表达。另外,CBS和CSE这两种酶同时表达在神经元的胞体中。9、内源性H2S对二指肠肌条收缩的影响及其机制加入CBS和CSE的底物L-cysteine(0.5mM和1mM)后,可以使十二指肠肌条收缩显著增强,这一增强作用在加药后2分钟左右达到最大,15分钟之内恢复正常。在浴槽中加入L-cysteine(1mM)2分钟之后,肌条运动积分的R值增加到1.9±0.1(n=9),与对照组(0.9±0.05,n=6)相比有明显差异(P<0.05)。PAG(CSE的抑制剂,0.5mM)和AOAA(CBS的抑制剂,0.05mM)孵育肌条可以显著减弱L-cysteine引起的兴奋作用。加入L-cysteine2分钟后,PAG和AOAA预处理组肌条的运动积分R值为1.3±0.1(n=7),与对照组(1.9±0.1,n=8)相比显著降低(P=0.009).TRPVl通道的拮抗剂Capsazepine或NK1受体的拮抗剂L703606预孵育都可以显著减弱L-cysteine(1mM)引起的肌条兴奋反应。浴槽中加入Capsazepine或L703606孵育15分钟后再加L-cysteine,第2分钟的运动积分R值分别为1.4±0.07(Capsazepine+L-cysteine组,n=13)和1±0.1(L703606+L-cysteine组,n=6),显著低于DMSO孵育后再加L-cysteine的R值(1.9±0.1,n=7)(P<0.05)。与L-cysteine相似的是,CBS的激动剂SAM(1mM)也使十二指肠肌条收缩显著增强,这一作用同样可被Capsazepine和L703606阻断。和NaHS引起的双相反应不同,L-cysteine和SAM对肌条收缩都没有抑制作用。结论：内源性和外源性H2S对十二指肠肌条的自发收缩都有短暂兴奋作用,这一作用是通过激活传入感觉神经末梢上的TRPV1通道从而导致P物质释放增多引起的。除此之外,外源性H2S还发挥长时间的抑制作用,这是作用是通过直接开放平滑肌细胞上的KATP通道介导的。H2S对TRPV1通道和KATP通道的调节可能都是通过蛋白硫氢化这一机制介导的。H2S可能激活了感觉传入神经末梢的传出样作用。第二部分硫化氢对十二指肠肌间神经丛S神经元电生理学特性的影响及其机制目的：消化道除受中枢神经系统调控外,其自身还有一套完整的自主神经系统,能够完成基本的反射活动,称作肠神经系统(enteric nervous system, ENS),内有感觉神经元、中间神经元和运动神经元,它们形成复杂的神经网络,调节消化道的感觉、运动、分泌和血流。根据其电生理学特征,肠神经丛内的神经元可以分为AH神经元和S神经元。AH神经元主要是肠道内源性感觉神经元,S型神经元主要为运动和中间神经元。内源性H2S可以在十二指肠肌间神经丛神经元合成,但是H2S对ENS中的神经元有何调节作用尚未见报道。本实验的目的是探讨H2S对肌间神经丛内S神经元电生理特性的影响及其机制。方法：肌间神经丛神经元分离与培养将LMMP标本(制备方法同第一部分)置于含10mg/ml木瓜蛋白酶的37℃Krebs溶液中消化50分钟,然后将组织剪碎,置于含1mg/ml Ⅱ型胶原酶的37℃DMEM培养基进行第二次消化,消化时间为55分钟。玻璃吸管轻轻吹打组织块数次,得到细胞悬液。将细胞悬液在1500r/min转速离心6分钟,弃去上清液,用1ml含10%胎牛血清的DMEM重新悬浮细胞并滴片,细胞贴壁后再加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。37℃培养箱培养16-24小时后进行全细胞膜片钳记录。全细胞膜片钳记录用阻抗为5-7MΩ的玻璃微电极与细胞膜形成GΩ以上的高阻封接,然后再给予细胞一个突然的负压吸引打破封接处的细胞膜,进行全细胞电信号记录。记录细胞膜电位时膜片钳放大器处于电流钳状态,不给予任何电流刺激,即I=)。观察电压变化激发膜电流时,放大器处于电压钳状态。细胞膜的电信号通过Axon膜片钳放大器和A/D转换器记录入计算机,使用Clampexl0.2软件进行信号采集和分析。AH和S神经元鉴别首先确定所记录神经细胞的阈电位,然后连续给予细胞三次时程为50ms的阈上电流刺激,连续激发三次动作电位。若在三个动作电位之后出现一段幅度为2-15mV,时程为3-20s的后超级化,则该细胞为AH神经元,若无后超级化则该细胞为S神经元。免疫荧光双重标记实验步骤同第一部分。数据统计与分析在观察膜电位改变时,以加NaHS前的膜电位作为基础值,以加药后膜电位超级化的最低值作为效应值,效应值减去基础值即为膜电位的改变。在观察外向电流改变实验部分,将钳制电位从-80mV直接升至+50mV会激发出一个短暂的内向离子流和持续的外向离子流,以加NaHS前膜电位钳制在+50mV时的外向电流的大小做为基础值,加NaHS后1分钟相同位置的电流大小减去基础值即为外向电流的改变。数据分析方法同第一部分。结果：1.NaHS对肌间神经丛S神经元膜电位的影响对细胞施加NaHS(0.1mM,0.5mM和1mM)约10秒钟后,细胞膜电位发生明显超级化反应,且呈现浓度依赖性。在加药后1分钟左右,膜电位达到最低点,超级化的幅度分别为3.9±0.7mV(n=9:NaHS0.1mM),7.6±1.3mV(n=15:NaHS0.5mM)和13.8±1.8mV(n=13:NaHS0.1mM),和对照组(0.2±0.3mV,n=7)相比均有显著性差异(P<0.05).NaHS引起的超级化反应经细胞外液冲洗可恢复至静息电位水平。低浓度的NaHS(0.01mM)不影响S神经元的膜电位。2.NaHS对S神经元外向离子流的影响在电压钳模式下,设置一个100ms的step,将钳制电位从-80mV升至+50mV,细胞首先出现一个短暂的内向电流,然后再出现快速失活的外向电流和持续平稳的外向电流。我们观察的指标为持续平稳期的外向电流大小。NaHS(1mM)作用1分钟后,从-80mV到+50mV的电压变化诱发的外向电流显著增加。加药后1分钟时NaHS组外向电流的增大幅度为619.2±47.9pA(n=17),显著高于对照组外向电流的改变(45.7±37.6pA,n=8,P<0.001).3.KATP通道在NaHS引起肌间神经丛S神经元外向电流增大中的作用用KATP通道阻断剂Glib预孵育细胞10分钟后,从-80mV到+50mV的电压变化诱发的外向电流在加入NaHS后不再增加。用Glib预处理后,NaHS使S神经元外向离子流增加的幅度由673.8±51.8pA(DMS0+NaHS组,n=13)降至73.7±46.1pA(Glib+NaHS组,n=8,P<0.001)。4.KATP通道在肌间神经丛神经元上的定位不管是在分离培养的肌间神经丛细胞上还是肌间神经丛标本上,所有的NeuN阳性细胞都表达Kir6.2,说明KATP通道在肌间神经丛神经元上表达。5.蛋白硫氢化机制在NaHS引起肌间神经丛S神经元外向电流增大中的作用用巯基保护剂NEM(0.1mM)孵育细胞10分钟后,NaHS不再引起外向电流增加。用NEM预处理后,NaHS使S神经元外向离子流增加的幅度由619.2±47.9pA(vehicle+NaHS组,n=17)降至137.7±63.3pA(NEM+NaHS组,n=7,P<0.001)。结论：外源性H2S使大鼠十二指肠肌间神经丛S神经元细胞膜电位超级化,这一作用可能是通过硫氢化S神经元上KATP通道介导的。