研究背景人脑胶质母细胞瘤(Glioblastoma Mutiforme,GBM)是成人中枢神经系统中最常见并且恶性程度最高的原发性肿瘤,在全部类型的脑胶质瘤中能够占到50%以上。根据组织病理学特征,世界卫生组织(World Health Organization,WHO)将脑胶质瘤按照恶性程度由低到高分为Ⅰ-Ⅳ四个等级,其中GBM被认定为星形细胞瘤病理类型中恶性程度最高的Ⅳ级。近年来,虽然针对GBM的传统手术切除联合放化疗、新型的抗血管生成治疗以及靶向免疫治疗等策略不断丰富和改进,但是在临床实践中仍未能取得令人满意的效果,GBM治愈率低,复发率高,患者预后极差。为了完善和补充当前的GBM治疗策略,改善患者的生存预后,进一步探索和揭示GBM恶性生物学进展的分子调控机制仍然十分迫切。低氧(Hypoxia)是实体性肿瘤微环境中最为普遍存在的标志性特征。由于氧气输送和氧气消耗之间的不平衡,约一半以上的实体肿瘤中存在广泛的低氧区域。低氧微环境和低氧诱导因子(Hypoxia Inducible Factor,HIF)所依赖的下游分子通路在肿瘤的恶性生物学进展中起到关键性的调节作用,其参与调控了肿瘤细胞的增殖、侵袭迁移,上皮表型向间充质表型的转变(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT),内皮血管新生,以及免疫逃逸。此外,临床研究数据表明低氧与多种肿瘤的远处转移、放化疗耐受性以及患者的不良预后有着紧密的联系。GBM作为恶性程度极高的实体肿瘤,存在广泛的低氧区域,然而其低氧下的分子调控机制尚未完全阐明。因此对这一机制的深入探索,有利于寻找新的治疗靶点,进而采取适当的手段降低胶质瘤细胞的恶性进展,改善胶质瘤患者的预后。细胞自噬(Autophagy)是一种利用自噬溶酶体回收、清除细胞内受损、变性或衰老的蛋白质和细胞器的自我消化分解代谢过程。这种自我清除代谢废物、重新回收能量的生理性代谢过程在细胞正常运转、自我修复、逃避恶劣环境等方面起到重要的作用。肿瘤细胞自噬的诱导为其自身提供了有效的额外供养途径,提高了清除细胞内有害物质的能力,有利于肿瘤细胞在低氧、低养、饥饿等恶劣微环境中的生存以及恶性生物学进展。越来越多的研究表明,低氧能够诱导GBM细胞自噬活性的增强,并且在一定程度上提高了其对化疗药物的耐受性。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一类长约19-22核苷酸的内源性、非编码单链RNA,通过作用于靶基因的3’非翻译区(3’ untranslated region,3’ UTR)导致靶基因mRNA降解或抑制其翻译,在转录后水平对基因进行调控。MiRNA在细胞生理学活动过程中的调节作用极其广泛,其中包括增殖、分化、凋亡以及自噬等。在GBM中,低氧微环境诱导大量miRNAs产生了差异性的表达,给miRNA表达谱留下了特定的低氧印迹。这些差异表达的miRNAs可能在低氧诱导的GBM细胞自噬水平的增高、侵袭迁移能力的增强以及耐药性的产生中起到关键性的调控作用。然而,低氧在GBM自噬活性以及恶性进展中作用的关键调控miRNAs仍然不十分明确,需要进一步深入研究。血管拟态(Vasculogenic Mimicry,VM)是完全不依赖于血管内皮细胞,由恶性肿瘤细胞自身形成的管道样脉络结构,具有供血功能。从血管拟态这种现象被定义以来,它在多种恶性肿瘤中被发现,其中包括GBM。血管拟态的形成增加了 GBM血流量,能够为低氧下生长迅速的胶质瘤细胞提供额外营养物质和氧气的供应。之前的研究表明,形成VM的肿瘤细胞具有产生可塑性表型的特性,这种表型的可塑性改变能够受到低氧的调节。值得我们注意的是,低氧能够通过诱导GBM细胞发生EMT促进血管拟态的形成。巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage Migration Inhibitory Factor,MIF)是具有促进炎症发生和促进肿瘤恶性进展双重功能的细胞因子。MIF在多种类型的恶性肿瘤中高度表达,其中包括GBM。近年来,对胶质瘤的深入的研究发现MIF表达水平与其临床病理分级以及浸润扩散程度具有密切的正相关关系。更重要的是,低氧能够进一步增加GBM中MIF的表达和分泌,而且MIF与GBM细胞的自噬、侵袭迁移、血管生成和免疫逃避有着密切联系。然而,低氧下MIF对GBM的作用和具体调控分子机制尚不清楚,仍有待进一步深入研究。本课题主要从低氧促进GBM细胞自噬以及血管拟态生成两方面进行研究,分别深入探讨了相关的miR224-3p和MIF对GBM的作用以及其具体作用机制。首先,从低氧下GBM细胞miRNA表达谱基因芯片入手,我们通过全面分析筛选发现芯片中显著下调的miR224-3p参与介导了低氧诱导的GBM自噬水平增强。随后,进一步深入研究了其对GBM的自噬作用及其具体机制。除此以外,我们发现MIF对低氧下GBM细胞血管拟态的形成有着关键的调控作用,并且进一步探索了其具体的分子机制。本课题对低氧下GBM恶性生物学进展的基础研究,为GBM患者提供了新的治疗靶点,有着重要学术意义和广阔的临床应用前景。第一部分MiR224-3p对低氧下胶质母细胞瘤自噬水平的影响及其作用机制的研究1.目的(1)基于miRNA表达谱基因芯片,通过分析常氧、低氧下GBM细胞miRNAs的差异表达,筛选出低氧下调的miRNAs中与自噬相关的miRNAs(miR224-3p)。(2)明确miR224-3p对低氧下GBM细胞自噬水平的调节作用,阐明miR224-3p调节GBM细胞自噬的具体作用机制和直接作用靶基因。(3)揭示胶质瘤组织中mmiR224-3p的表达水平,以及miR224-3p与靶基因表达量之间的相关性。(4)探究miR224-3p对GBM细胞增殖和低氧诱导凋亡的作用。(5)明确miR224-3p对GBM细胞体内成瘤生长的影响。2.方法(1)细胞低氧处理及m i RNA芯片的检测通过低氧培养箱实现物理性低氧,培养条件设定为:37℃,5%CO2,1%O2。分别提取低氧处理组(24h)和对照组U251细胞的总miRNAs,进行miRNA表达谱的检测,经过分析获取全面的miRNA表达谱原始数据。(2)mRNA,miRNA和蛋白水平的检测收集不同WHO级别临床胶质瘤组织后,提取总mRNA和制备石蜡切片,应用荧光实时定量PCR(q-PCR)和免疫组织化学技术分别检测各相关miRNAs、mRNAs和蛋白分子的表达水平。对U251和U87两种GBM细胞系进行特定的处理并分别提取总RNA和总蛋白,使用q-PCR和Western blot技术检测U251和U87细胞内相关mRNAs,miRNAs和蛋白分子的表达水平。(3)细胞转染及GFP-LC3稳定细胞系的构建分别用 miR224-3p mimics,miR224-3p inhibitor,ATG5 质粒,FIP200 质粒,含有miR224-3p互补结合序列的ATG5 3’ UTR突变型或野生型荧光素酶报告基因质粒,含有miR224-3p互补结合序列的FIP200 3’ UTR突变型或野生型荧光素酶报告基因质粒对U251和U87细胞进行Lipo2000脂质体瞬时转染,用于过表达或敲除目的蛋白或miR224-3p,进而研究各种相关指标的表达水平的变化。将含有GFP-LC3B编码序列的质粒用慢病毒进行包装,通过共培养转染U251和U87细胞系,构建稳定表达GFP-LC3B绿色荧光蛋白细胞系后,对自噬水平进行动态监测。(4)胶质瘤细胞自噬水平检测对自噬水平的检测分为以下几种方法:①透射电子显微镜直接观察U251细胞中典型双层膜结构自噬小体的数量,此方法为监测自噬的金标准。②Western blot技术检测U251和U87细胞自噬主要标志性蛋白LC3B和P62表达水平。③倒置荧光显微镜观察GFP-LC3B稳定表达U251和U87细胞中荧光自噬小体阳性细胞,并统计计算阳性细胞比例。④自噬小体和溶酶体融合抑制剂巴弗洛霉素A1(BafilomycinAl,BAF)药物应用于自噬流的检测。(5)M i R224-3p下游调控靶点预测以及荧光素酶报告基因实验利用miRNA靶基因数据库(如:targetscan、PicTar、miRanda等)筛选出miR224-3p最可能直接作用的自噬相关靶基因。之后通过q-PCR和Western blot进行验证。最后,分别对U251和U87细胞进行miR224-3p mimics和含有靶基因突变型或野生型结合位点的荧光素酶报告基因质粒共转染后,进行双荧光素酶基因报告实验确定miR224-3p直接作用的靶基因。(6)胶质瘤细胞增殖和凋亡检测分别对 U251 和 U87 细胞进行 miR224-3p mimics 和 miR224-3p inhibitor 瞬时转染,然后用CCK-8和EdU试剂盒检测不同时间点GBM细胞活力和增殖能力。用Annexin V-FITC双染流式试剂盒和抗裂解的caspase3免疫细胞化学方检测低氧诱导转染miR224-3p mimics的U251和U87细胞凋亡水平。(7)裸鼠皮下人脑GBM细胞成瘤实验用U87细胞系建立裸鼠皮下异位成瘤模型。U87细胞在皮下成瘤后,行瘤内注射lenti-miRNA224-3p mimics和lenti-NCm慢病毒,同时间隔1天测量miR224-3p mimics组和NCm组肿瘤体积以及终末肿瘤重量。3.结果(1)低氧诱导GBM明细胞自噬水平的增强Western blot和GFP-LC3B稳定细胞系荧光自噬小体检测分别显示,与常氧组相比,GBM细胞U251和U87在低氧下自噬水平增强(LC3BⅡ升高,P62降低,自噬小体阳性细胞比例升高),且呈处理时间梯度依赖效应。BAF自噬流阻断实验显示低氧诱导U251和U87细胞自噬流被明显阻断(LC3BⅡ和P62表达均明显升高),进一步验证了以上结论。(2)在GBM细胞中,低氧诱导miR224-3p表达下调;在人脑胶质瘤组织中,miR224-3p呈低水平表达U251细胞miRNA表达谱芯片分析结果显示,miR224-3p为筛选出的低氧下调最显著的mmmiRNA。Q-PCR检测结果进一步验证,低氧下U251和U87细胞中miR224-3p表达水平明显下降。30例临床胶质瘤组织(14例低级别胶质瘤,WHOⅠ,Ⅱ级和16例高级别胶质瘤,WHO Ⅱ,Ⅳ级)和6例正常脑组织q-PCR结果显示,与正常脑组织相比,miR224-3p在胶质瘤组织中明显低表达。(3M i R224-3p参与调控低氧诱导的胶质瘤母细胞瘤细胞自噬水平的增强透射电子显微镜、Western blot和GFP-LC3B细胞系荧光自噬小体检测分别发现,常氧下,敲除内源性miR224-3p的U251和U87细胞自噬及自噬流水平明显增强;低氧下,过表达miR224-3p能够阻断U251和U87细胞自噬水平的升高。(4)MiR224-3p通过直接作用于下游靶基因ATG5和FIP200调节胶质瘤母细胞瘤细胞的自噬水平Q-PCR和Western blot检测显示,在众多miR224-3p预测的自噬相关靶基因中,过表达和敲除miR224-3p分别同时明显降低和升高FIP200和ATG5表达。而且,共同过表达FIP200和ATG5能够逆转miR224-3p过表达对低氧诱导自噬的阻断作用。更进一步的双荧光素酶报告基因实验结果发现,miR224-3p能够分别与FIP200和ATG5的3’ UTR中的互补序列结合发挥直接靶向抑制作用。(5)在人脑胶质瘤组织中,m i R224-3p含量与FIP200和ATG5的表达水平具有负性相关关系免疫组化检测发现,胶质瘤组织中低氧标志物HIF1 α和自噬标志物LC3B较正常脑组织明显高表达。同时经过定量和统计学分析发现,30例不同病理级别胶质瘤组织FIP200和ATG5的表达水平分别和miR224-3p的含量呈现出有明显统计学意义的负相关关系。(6)MiR224-3p减弱胶质瘤母细胞瘤细胞增殖能力,并且能够增加低氧诱导的GBM细胞的凋亡。CCK-8法和EdU法检测分别显示,过表达miR224-3p的U251和U87细胞活力和增殖能力明显增强,反之亦然。Annexin V-FITC双染流式试剂盒和抗裂解的caspase3免疫细胞化学方法检测发现,过表达miR224-3p能够显著提高低氧诱导的U251和U87细胞凋亡水平。(7)在体内实验中,m i R224-3p抑制GBM的生长利用U87细胞系建立裸鼠皮下人脑胶质瘤异位成瘤模型进行体内实验发现,miR224-3p mimics慢病毒组肿瘤平均体积和平均终末重量均显著低于对照慢病毒组。4.结论(1)通过miRNA表达谱分析,首次筛选出并且证实了 miR224-3p在低氧诱导的GBM细胞自噬增强中起到关键性的调节作用。(2)低氧能够明显降低GBM细胞miR224-3p的表达水平。(3)MiR224-3p通过抑制自噬相关基因FIP200和ATG5的表达来负性调节GBM细胞的自噬水平。(4)MiR224-3p通过结合FIP200和ATG5 mRNA的3’ UTR直接抑制靶基因的表达水平。(5)在胶质瘤组织中,miR224-3p较正常脑组织表达水平低;并且miR224-3p分别与FIP200和ATG5的表达量成负相关的关系。(6)MiR224-3p能够减弱GBM细胞的增殖能力以及增强低氧诱导的GBM细胞凋亡敏感性。(7)MiR224-3p能够抑制GBM细胞体内的生长。第二部分MIF在低氧诱导胶质母细胞瘤EMT和血管拟态生成中的作用以及其具体机制的研究1.目的(1)在胶质瘤临床组织中,研究低氧指标HIF1α分别与MIF和MIF受体CXCR4表达量之间的相关性。(2)在胶质瘤临床组织中,揭示HIF1α,MIF,CXCR4和VM四者之间的相关性;并且对MIF、CXCR4的表达水平以及VM阳性对胶质瘤患者预后的影响进行统计学分析。(3)明确低氧对GBM细胞EMT以及VM生成的影响。(4)阐明MIF在低氧诱导GBM细胞EMT和VM形成中的关键调节作用。(5)通过特异性药物阻断MIF的下游CXCR4相关信号通路,探究MIF在低氧诱导的GBM细胞EMT和VM生成中的具体作用机制。(6)应用裸鼠皮下GBM细胞成瘤实验,在体内水平验证MIF在EMT中的作用及其下游的具体通路机制。2.方法(1)细胞低氧处理及mRNA和蛋白水平的检测常氧和低氧下,对U251和U87两种GBM细胞进行相应的rhMIF、AMD3100、LY294002,ISO-1处理刺激后,分别提取总RNA和总蛋白。然后使用q-PCR和Western blot方法检测U251和U87细胞内需要检测的相关EMT标志物mRNAs和蛋白分子的表达水平。(2)细胞转染用Lipofectamine 2000对siMIF进行瞬时转染,用于敲除U251和U87细胞内源性MIF的表达,进而检测各种相关EMT标志蛋白表达水平的变化。(3)临床组织标本免疫组化和免疫荧光收集临床不同WHO级别的胶质瘤组织[25例临床胶质瘤组织(12例低级别胶质瘤,WHO Ⅰ,Ⅱ级和13例高级别胶质瘤,WHO Ⅲ,Ⅳ级)和6例正常脑组织],制备石蜡切片。然后应用免疫组化检测不同级别胶质瘤组织中HIF1 α、MIF、CXCR4的表达水平及血管拟态的生成[CD34与PAS(过碘酸希夫反应)共染阳性]情况。应用免疫组织化学和免疫荧光检测连续石蜡切片中HIF1 α、MIF、CXCR4以及血管拟态的共定位现象。(4)细胞免疫荧光对U251和U87细胞分别进行低氧以及相应的rhMIF、AMD3100、LY294002、ISO-1处理刺激。然后用4%多聚甲醛固定,通过免疫荧光方法检测细胞中MIF、CXCR4、上皮表型标志物E-Cadherin的表达水平。(5)胶质瘤细胞血管拟态形成实验利用基质胶3D环境,对低氧以及rhMIF、AMD3100、LY294002、ISO-1分别处理后的U87细胞进行血管拟态形成实验,检测不同处理因素对U87细胞形成血管拟态能力的影响。(6)裸鼠体内试验用GBM细胞系U87建立人脑胶质瘤荷瘤裸鼠皮下异位模型。U87细胞在皮下成瘤后,随机分为五组,分别行瘤周注射PBS,rhMIF,rhMIF和AMD3100,rhMIF和LY294002,ISO-1。三周后进行终末肿瘤体积的测量,并且对肿瘤进行石蜡包埋切片,进行免疫组化染色,检测组间N-cadherin(间充质表型标志物)和E-cadherin(上皮表型标志物)的表达水平。3.结果(1)在临床胶质瘤标本中,MIF和CXCR4的表达水平与HIF1 α含量呈正相关关系免疫组化检测结果显示,MIF、CXCR4和HIF1α的表达水平在胶质瘤中明显高于正常脑组织,并且高级别胶质瘤高于低级别胶质瘤。同时,定量统计学分析结果表明,HIF1α分别与MIF和CXCR4的表达水平呈线性正性相关关系。连续石蜡切片免疫荧光检测结果发现,MIF和CXCR4的表达与HIF1 α在胶质瘤组织中存在共定位现象。(2)在胶质瘤组织中,血管拟态的形成与MIF和CXCR4的共同高表达密切相关PAS染色和CD34免疫组化共染结果显示,VM形成标本阳性率在高级别胶质瘤中明显高于低级别,并且共同高表达MIF和CXCR4与VM的形成明显正相关。连续石蜡切片免疫组化结果发现,MIF、CXCR4、HIF1α和VM在胶质瘤组织中存在共定位现象。进一步的生存分析结果显示,VM阳性的胶质瘤患者生存期明显低于VM阴性患者。(3)MIF和CXGR4的表达水平在低氧下升高,并且低氧和MIF诱导EMT和VII的形成Western blot、q-PCR和细胞免疫荧光检测结果发现,MIF和CXCR4的表达在低氧下明显升高,以及低氧和MIF促进EMT(上皮样表型标志物E-cadherin的下降和间充质表型标志物N-cadherin、Vimentin的升高)。VM形成实验结果表明,低氧和MIF能够促进GBM细胞VM形成。(4)低氧通过MIF-CXCR4-AKT-EMT通路促进胶质瘤母细胞瘤细胞的VM形成Q-PCR、Western blot检测和VM形成实验结果显示,MIF诱导的EMT和VM形成能够被CXCR4和AKT抑制剂阻断。而且,低氧诱导的EMT和VM形成能够被MIF、CXCR4和AKT抑制剂阻断。(5)在体内,MIF促进GBM的EMT和生长。裸鼠皮下成瘤实验结果发现,MIF处理组皮下肿瘤体积明显高于PBS组、MIF+AMD3100组和MIF+ LY294002组,并且ISO-1组肿瘤体积小于PBS组。裸鼠皮下肿瘤免疫组化结果显示,MIF组肿瘤细胞有显著的EMT表现(E-cadherin降低,N-cadherin升高),而其它组无明显影响。4.结论(1)胶质瘤组织中存在抗内皮细胞血管新生治疗的补偿途径VM。(2)在胶质瘤组织中,HIF1α分别与MIF和CXCR4的表达水平呈正相关关系。(3)在胶质瘤组织中,HIFIα、MIF、CXCR4和VM四者存在共定位的密切联系。(4)低氧能够分别增强GBM细胞MIF和CXCR4的表达水平,并且促进GBM细胞EMT和VM的形成。(5)MIF在低氧诱导的GBM细胞EMT和VM形成中起到关键性的调节作用。(6)低氧下MIF和CXCR4表达水平的共同升高激活了 GBM细胞CXCR4下游AKT通路,促进了 EMT的发生,进而增强了 VM形成的能力。(7)MIF通过CXCR4-AKT-EMT通路促进了 GBM细胞体内的恶性生物学进展。