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由于缺少经典意义的获得性免疫相关因子,无脊椎动物被认为主要依靠先天的非特异性免疫系统,识别和清除入侵的病原微生物。近年来无脊椎动物免疫反应已经成为免疫学研究的热点,无论是细胞或体液免疫,无脊椎动物抵御病原菌入侵关键的第一步都是对外源入侵物的识别,为了进一步揭示宿主体内识别和防御病原菌的机制,以及初步探讨不同进化层次动物体液中与细菌相互结合蛋白(细菌结合蛋白)的进化关系,本文采用快速鉴定与病原菌互作的宿主蛋白的方法,研究了中国圆田螺、中国对虾、果蝇、文昌鱼和小白鼠体内与病原微生物结合的细菌结合蛋白。结果发现中国圆田螺体内的kelch repeat protein、28Sribosomal protein S15和actin,中国对虾血清中的hemocyanin、zinc finger protein630和Hsp70等,果蝇体内的glycogen phosphorylase、ATP synthase beta subunit、muscle myosin heavy chain、actin87E、actin-88F和tubulin beta-1 chain,文昌鱼体液中的aryl hydrocarbon receptor、creatine kinase、variable lymphocyte receptordiversity region、SCP和T-box protein AmphiTbx,以及小白鼠体内的immunoglobulin heavy chain variable region和complement component3等为细菌结合蛋白。并且其中的kelch repeat protein、actin、hemocyanin、zinc finger protein630、Hsp70、ATP synthase beta subunit、muscle myosin heavy chain、tubulin beta-1chain和SCP等细菌结合蛋白在宿主受病原菌免疫攻毒时,与对照组相比较表达量都发生了变化,提示其为相应宿主重要的免疫防御相关因子。对以上各不同进化层次动物体内细菌结合蛋白进一步分析发现,这些细菌结合蛋白反映出了免疫系统伴随着生物的进化不断演化,并且还发现某些免疫因子(如甲壳类动物特有的hemocyanin、一般存在于无脊椎动物体内的giant extracellular hemoglobin linker1 chain和SCP等)为某个进化水平的动物所特有。上述结果对进一步确定宿主体内,特别是无脊椎动物体内识别病原菌的免疫相关因子具有重要的参考价值,并对免疫进化的研究提供了新的思路。
试验通过副溶血弧菌(Vp)、金黄色葡萄球菌(Sa)和嗜水气单胞菌(Ah)分别对文昌鱼进行免疫攻毒,统计了对照组和试验组文昌鱼的受伤率和保护率,并进行卡方检验,结果发现Vp免疫攻毒组和Sa免疫Vp攻毒组的保护率与生理盐水免疫Vp攻毒组的相比都有显著的提高,Sa免疫攻毒组的保护率与生理盐水免疫Sa攻毒组的相比也有显著的提高。并且本研究通过制备抗SCP和CaVP多克隆抗体来检测SCP和CaVP在上述几组文昌鱼的体内表达的变化情况。结果发现,文昌鱼肠道中SCP的表达量受病原菌的诱导而增加,且受伤组的表达量明显比健康组的低:同时也发现文昌鱼的肠道和鳃中的CaVP表达量也可以受病原菌的诱导而增加。同样,在这两种组织中受伤组CaVP的表达量也明显比健康组的低,这是国内外首次发现同为钙结合蛋白的SCP和CaVP在文昌鱼的免疫反应中具有重要的作用。综合以上结果证明了文昌鱼的免疫反应具有一定的免疫记忆能力和特异性。此外本研究证明了肠道和鳃是文昌鱼重要的免疫器官,这对进一步认识文昌鱼的免疫系统提供了有价值的资料。
本试验还通过制备多克隆抗体方法,检测在细菌攻毒的条件下果蝇体内的glycogen phosphorylase、ATP synthase beta subunit、actin87E、actin-88F、heat shock70 kDa protein和beta-1 tubulin的表达变化情况,结果发现在大肠杆菌K12和Sa同种免疫攻毒下,果蝇体内的glycogen phosphorylase、ATP synthase beta subunit、actin87E、actin-88F、heat shock70 kDa protein和beta-1 tubulin的表达量和对照相比较都有明显提高,推测果蝇体内的这六个蛋白参与果蝇防御病原微生物的免疫反应。其中glycogen phosphorylase、ATP synthase beta subunit和beta-1 tubulin与果蝇免疫功能有关为国内外首次发现。试验还通过Western-blotting等方法初步确定了大肠杆菌外膜蛋白OmpA能与ATP synthase beta subunit,Slp能与heatshock70 kDa protein,OmpA、OmpC、YncD和OmpX能与Actin-88F,OmpA和Slp能与actin87E,OmpG能与tubulin beta-1 chain相互作用,结果表明这些外膜蛋白可能是被果蝇免疫系统识别的蛋白。此外,本试验还通过Co-IP等方法初步确定了果蝇体内与glycogen phosphorylase、ATP synthase beta subunit、actin87E、actin-88F、heat shock70 kDa protein和beta-1 tubulin相互作用蛋白,为寻找由这六个蛋白启动的免疫反应通路打下基础。